兩種生態(tài)類型蚯蚓血液蛋白質(zhì)組分電泳分析

摘要：采用聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）技術(shù)對(duì)不同生態(tài)類型的微小雙胸蚓（Bimastus parvus）和威廉環(huán)毛蚓（Pheretima guillelmi）血液蛋白質(zhì)進(jìn)行分離比較。結(jié)果表明，威廉環(huán)毛蚓血液蛋白質(zhì)電泳擴(kuò)增出6條條帶，微小雙胸蚓血液蛋白質(zhì)電泳擴(kuò)增出5條條帶，表?xiàng)偷奈⑿‰p胸蚓比內(nèi)棲型的威廉環(huán)毛蚓少了一個(gè)組分。形成血液蛋白質(zhì)組分的差異性可能與蚯蚓生態(tài)適應(yīng)性有關(guān)。

關(guān)鍵詞：微小雙胸蚓（Bimastus parvus）；威廉環(huán)毛蚓（Pheretima guillelmi）；血液；蛋白質(zhì)組分；聚丙烯酰胺凝膠電泳

中圖分類號(hào)：S899.8 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）03-0753-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.03.052

Abstract： Two distinct ecological categories of earthworm Bimastus parvus and Pheretima guillelmi blood protein were separated and studied with the help of PAGE technology. The results indicated that the Bimastus parvus blood protein had 6 electrophoresis belt number and Pheretima guillelmi blood protein had 5 electrophoresis belt number， epigeic Bimastus parvus showed less a component than endogeic Pheretima guillelmi. The formation of blood protein components difference may be related to earthworm ecological adaptability.

Key words： Bimastus parvus； Pheretima guillelmi； blood； protein components； PAGE

蚯蚓屬于環(huán)節(jié)動(dòng)物門（Annelida）寡毛綱（Oligochaeta）陸生動(dòng)物，廣泛存在于土壤生態(tài)系統(tǒng)中。在土壤生態(tài)系統(tǒng)中，蚯蚓占土壤生物量的60%～80%，是土壤生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分[1，2]。作為一類在自然界中存在了6億年的古老動(dòng)物，蚯蚓在漫長(zhǎng)的進(jìn)化過(guò)程中形成了攝食行為[3]、回避行為[4]、掘穴行為[5]、光感行為[6]等生態(tài)學(xué)特征。在蚯蚓的生態(tài)適應(yīng)性上，呈現(xiàn)出表?xiàng)停‥pigeic）、內(nèi)棲型（Endogeic）和深棲內(nèi)棲型（Anecic）三種習(xí)性，屬于差別比較大的生態(tài)類群[7]。另外，在分子和細(xì)胞水平上，由于蚯蚓處于食物鏈底端，與土壤中的各種污染物接觸相對(duì)密切，蚯蚓體內(nèi)形成了獨(dú)特而有效的免疫與抗菌系統(tǒng)[8]、抗氧化酶防御系統(tǒng)[9]、高活性的纖維素水解酶[10]以及細(xì)胞色素 P450、GST、AChE等對(duì)環(huán)境污染響應(yīng)比較敏感的酶系[11]，以適應(yīng)不良的生存環(huán)境和對(duì)抗不利因素。在蚯蚓的生態(tài)適應(yīng)性的生理水平上，為了適應(yīng)長(zhǎng)期在土壤中的生存，蚯蚓通過(guò)濕潤(rùn)的體壁來(lái)進(jìn)行呼吸氧氣并排出血液中的二氧化碳，在生理上形成了由縱血管、環(huán)血管和微血管組成的多心臟（4～5對(duì)）的閉管式循環(huán)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)。本試驗(yàn)采用（PAGE）技術(shù)對(duì)表?xiàng)偷奈⑿‰p胸蚓（Bimastus parvus）和內(nèi)棲型的威廉環(huán)毛蚓（Pheretima guillelmi）的血液蛋白質(zhì)組分進(jìn)行了分析，比較了不同生態(tài)類型蚯蚓血液中蛋白質(zhì)組分的差異性，為進(jìn)一步研究蚯蚓的生態(tài)適應(yīng)性提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料、藥品與儀器

材料：微小雙胸蚓和威廉環(huán)毛蚓，采自成都某農(nóng)場(chǎng)的大田土壤中。

主要藥品與設(shè)備：丙烯酰胺（Acr）、N，N-亞甲基雙丙烯酰胺（Bis）、四甲基乙二胺（TEMED）、核黃素過(guò)硫酸銨（AP）、三羥甲基氨基烷（Tris）、甘氨酸Gly-溴酚藍(lán)等均為分析純。GL-20G-Ⅱ型高速冷凍離心機(jī)，DY-501型電泳儀，DYCZ -24D型電泳槽，AcerScan 620P 掃描儀。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蚯蚓血液的采集 選擇成熟的微小雙胸蚓和威廉環(huán)毛蚓，用pH 6.8 的PBS緩沖液反復(fù)沖洗干凈，從背側(cè)的心臟部位進(jìn)行局部剪開(kāi)，用擠壓方法使一對(duì)心臟露出，用0.5 mL的注射器配以特制的細(xì)針快速刺入心臟抽取血液。把采集到的蚯蚓血液注射到預(yù)先冷卻至4 ℃、放有少量0.53% NaCl的離心管中，在5 000 r/min離心10 min除去白細(xì)胞。放置到電極緩沖液的燒杯中，在4 ℃左右透析48 h，備用。

1.2.2 電泳制膠 分離膠和的濃縮膠的制備：7%的聚丙烯酰胺分離膠和2.5%的聚丙烯酰胺濃縮膠的制備方法均與蚯蚓體腔液電泳制膠相同[12]。待分離膠和的濃縮膠聚合完全后，備用。

1.2.3 加樣電泳 取透析后的血液樣品25 μL，加在電泳的凝膠上表面，除去凝膠表面與電極緩沖液之間的氣泡。按照文獻(xiàn)[12]的電壓、電流控制方式電泳后進(jìn)行固定染色和脫色[13]，可以看到清晰的蚯蚓血液凝膠電泳后的圖譜。

2 結(jié)果與分析

經(jīng)過(guò)4次重復(fù)電泳，威廉環(huán)毛蚓和微小雙胸蚓心臟血液蛋白質(zhì)的電泳條帶有所不同，結(jié)果如圖1所示。從這兩種不同生態(tài)類型的蚯蚓心臟血液電泳條帶（圖1）和掃描圖（圖2和圖3）的對(duì)比來(lái)看，威廉環(huán)毛蚓心臟血液電泳的結(jié)果中能清晰地分辨出6條條帶；微小雙胸蚓心臟血液電泳結(jié)果中能清晰地分辨出5條條帶。

從血液的電泳結(jié)果比較來(lái)看，生態(tài)類型不同的微小雙胸蚓和威廉環(huán)毛蚓血液蛋白組分存在一定的差異性。表1為威廉環(huán)毛蚓和微小雙胸蚓血液電泳區(qū)條帶的相對(duì)遷移率（Rm）。由表1可知，二者的相對(duì)遷移率差異較大，表?xiàng)偷奈⑿‰p胸蚓比內(nèi)棲型的威廉環(huán)毛蚓少了一個(gè)組分。

3 小結(jié)與討論

蚯蚓作為“生態(tài)系統(tǒng)工程師”，在土壤生態(tài)系統(tǒng)中同時(shí)發(fā)揮著消費(fèi)者、分解者和調(diào)節(jié)者的功能[14]。從行為生態(tài)學(xué)的角度看，蚯蚓的生態(tài)適應(yīng)性是與其繁殖策略、生存策略、種群密度和社會(huì)行為等相互聯(lián)系的。蚯蚓的不同生活習(xí)性，以及在分子、細(xì)胞水平和生理所形成的防御系統(tǒng)是生存策略的具體表現(xiàn)形式。在蚯蚓的覓食行為和食性偏好上，表?xiàng)万球旧钤谕寥辣韺又校且灾参锏臍埪湮锖涂葜β淙~層作為食物的主要來(lái)源；內(nèi)棲型蚯蚓生活在土壤亞表層中，其食物的主要來(lái)源是腐爛狀態(tài)的有機(jī)物殘?bào)w。由于血液具有在物質(zhì)運(yùn)輸、調(diào)節(jié)、保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、防御和保護(hù)等重要的生理功能，因此在長(zhǎng)達(dá)數(shù)億年的進(jìn)化過(guò)程中，不同生態(tài)類型蚯蚓血液蛋白組分的不同可能與其進(jìn)化的歷史有關(guān)。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)兩種不同生態(tài)類型的蚯蚓血液蛋白質(zhì)進(jìn)行電泳分析發(fā)現(xiàn)，在血液蛋白的組成上，表?xiàng)偷奈⑿‰p胸蚓比內(nèi)棲型的威廉環(huán)毛蚓少了一個(gè)組分，這可能與蚯蚓種屬的特異性有關(guān)，另一方面也可能是蚯蚓的生存適應(yīng)環(huán)境以及進(jìn)化演變的一種結(jié)果。

參考文獻(xiàn)：

[1] JOUQUET P， PLUMERE T，THU T D，et al. The rehabilitation of tropical soils using compost and vermicompost is affected by the presence of endogeic earthworms[J]. Applied Soil Ecology， 2010，46（1）：125-133.

[2] 王獻(xiàn)溥，劉玉凱.生物多樣性的理論與實(shí)踐[M]. 北京：中國(guó)環(huán)境科學(xué)出版社，1994.

[3] CURRY J P， SCHMIDT O.The feeding ecology of earthworms[J].Pedobiologia，2007，50（6）：463-477.

[4] 卜春紅，高大文.蚯蚓回避反應(yīng)在生態(tài)毒理研究中的應(yīng)用進(jìn)展[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2006（25）：799-804.

[5] 愛(ài)德華茲 C A，洛夫蒂 J R.蚯蚓生物學(xué)[M].戴愛(ài)云，范果儀，譯. 北京：科學(xué)出版社，1984.

[6] HOWELL C D.The response to light in the earthworm Pheretima agrestis goto and Hatai with special reference to the function of the nervous systems[J]. J Exp Zool，2005，81（2）：231-259.

[7] 邱江平.蚯蚓及其在環(huán)境保護(hù)上的應(yīng)用Ⅱ：蚯蚓生態(tài)毒性[J].上海農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，1999，17（4）：301-308.

[8] 王 沖，孫振鈞，鄭冬梅.蚯蚓抗菌的免疫生態(tài)學(xué)研究進(jìn)展[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2006，17（3）：525-529.

[9] 黃初龍，張雪萍.蚯蚓環(huán)境生態(tài)作用研究進(jìn)展[J].生態(tài)學(xué)雜志，2005，24（12）：1466-1470.

[10] 張寶貴，李貴桐，孫 釗，等.兩種生態(tài)類型蚯蚓幾種消化酶活性比較研究[J].生態(tài)學(xué)報(bào)，2001，21（6）：978-981.

[11] 李培軍，熊先哲，楊桂芬，等.動(dòng)物生物標(biāo)志物在土壤污染生態(tài)學(xué)研究中的應(yīng)用[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2003，14（12）：2347-2350.

[12] 徐曉燕，何應(yīng)森，程 東，等.兩種生態(tài)型蚯蚓體腔液蛋白質(zhì)組分的分析[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，50（18）：3866-3868.

[13] 秦 慧，劉 霆，柳 斌，等.幾種雙向凝膠電泳蛋白質(zhì)檢測(cè)方法的比較[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2006，14（1）：168-172.

[14] 張衛(wèi)信，陳迪馬，趙燦燦.蚯蚓在生態(tài)系統(tǒng)中的作用[J].生物多樣性，2007，15（2）：142-153.