畢赤酵母發(fā)酵不同單糖產(chǎn)乙醇的研究

摘要：以畢赤酵母CBS 6054（Scheffersomyces stipitis）為試驗(yàn)菌株，用葡萄糖和半乳糖2種六碳糖，木糖和阿拉伯糖2種五碳糖分別作為惟一碳源進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，測定畢赤酵母在不同培養(yǎng)基中的生長曲線、糖消耗情況、產(chǎn)物乙醇生成情況，由此研究該菌株發(fā)酵不同單糖的能力以及對應(yīng)的產(chǎn)乙醇的潛力。結(jié)果表明該菌株對葡萄糖和木糖的發(fā)酵能力較強(qiáng)，且兩者發(fā)酵情況相當(dāng)；發(fā)酵半乳糖的能力居中；發(fā)酵阿拉伯糖的能力較弱。乙醇產(chǎn)量從高到低依次是葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖。

關(guān)鍵詞：畢赤酵母（Scheffersomyces stipitis）；五碳糖；六碳糖；燃料乙醇

中圖分類號：Q939.97 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號：0439-8114（2016）03-0716-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.03.042

Abstract：Using two kinds of hexose includes glucose and galactose， two kinds of pentose includes xylose and arabinose respectively as the sole carbon source of the medium in Scheffersomyces stipitis’ fermentation tested to produce ethanol. In order to study the capacity of Scheffersomyces stipitis consuming different monosaccharide， the strain’s growth curve， sugar consumption， production of ethanol would be measured. The results showed that this strain could ferment glucose and xylose well and the fermentation of two monosaccharide were equal. The ability to ferment galactosewas medium and the ability to ferment arabinose was weak. Ethanol production descending order were glucose， xylose， galactose， arabinose.

Key words：Scheffersomyces stipitis； pentose； hexose； fuel ethanol

生物燃料乙醇是一種清潔型的可再生資源，可以通過微生物發(fā)酵生物有機(jī)質(zhì)得到，是一種有發(fā)展前景的液體燃料。傳統(tǒng)的乙醇生產(chǎn)是以糧食為原料，現(xiàn)在人們嘗試以木質(zhì)纖維素（如秸稈、谷殼、木屑等廢棄物）為原料生產(chǎn)乙醇，每年全球產(chǎn)生的木質(zhì)纖維素約占生物資源的一半，大約100～500億t[1]，利用這部分資源不僅可以降低生產(chǎn)燃料乙醇的成本，還有利于保護(hù)自然環(huán)境，實(shí)現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展。

木質(zhì)纖維素中纖維素含量最多，占干重的45%，半纖維素含量次之，占干重的30%[2，3]。纖維素水解后生成葡萄糖，半纖維素水解后生成五碳糖（如木糖、阿拉伯糖）和六碳糖（如半乳糖、甘露糖和葡萄糖）。除葡萄糖外，若能充分利用木質(zhì)纖維素中的木糖，可使乙醇產(chǎn)量再增加25%[4，5]。從自然界中篩選到的能利用木糖發(fā)酵產(chǎn)乙醇的酵母菌中，樹干畢赤酵母（Scheffersomyces stipitis）具有較好的應(yīng)用前景[6-8]。目前，鮮見關(guān)于此類酵母對多種單糖發(fā)酵效果的比較研究。利用畢赤酵母發(fā)酵不同單糖產(chǎn)乙醇，使纖維素水解液中的成分能得到充分利用，這對于降低燃料乙醇的成本，提高乙醇產(chǎn)量具有重要的意義。根據(jù)纖維原料水解后產(chǎn)生的單糖種類特征，本研究選取了2種六碳糖（葡萄糖和半乳糖），2種五碳糖（木糖和阿拉伯糖）分別作為培養(yǎng)基的惟一碳源，利用畢赤酵母CBS 6054菌株進(jìn)行發(fā)酵，記錄發(fā)酵過程中菌株的生長情況和單糖的消耗情況，并測定發(fā)酵中對應(yīng)的乙醇產(chǎn)量，為了解畢赤酵母CBS 6054菌株對不同糖類的發(fā)酵特性、開發(fā)工業(yè)化的五碳糖和六碳糖共發(fā)酵產(chǎn)乙醇菌株奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株 畢赤酵母CBS 6054由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所菌種資源庫提供。

1.1.2 主要試劑 葡萄糖（阿拉丁試劑有限公司），木糖（上海楷洋生物技術(shù)有限公司），氫氧化鈉（湖南匯虹試劑有限公司），亞硫酸氫鈉（天津市大茂化學(xué)試劑公司）；阿拉伯糖、半乳糖、3，5-二硝基水楊酸、結(jié)晶酚、酒石酸鉀鈉均為國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，均為分析純。

1.1.3 主要儀器 電子分析天平（UX6200H型，日本島津制作所）；立式壓力蒸汽滅菌器[GR110DR型，致微（廈門）儀器有限公司]；氣浴恒溫振蕩器（THZ-82B型，江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠）；離心機(jī)（TGL-16C型，深圳安科高技術(shù)股份有限公司）；細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（TC20型，BIO-RAD公司）；電熱恒溫水浴鍋（HH·SY21-Ni型，北京長源實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）；烘箱（上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；酶標(biāo)儀（Multiskan GO型）、氣相色譜儀（TRACE 1300型），Thermo Scientific公司；超純水器（湖南科爾頓水務(wù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵液樣品的制備 按表1 配制5種不同的培養(yǎng)基，裝入三角瓶中，同一時(shí)間接種活化后的CBS 6054菌液，在30 ℃ 180 r/min的搖床中培養(yǎng)，發(fā)酵0、8、16、24、32、40、48、56、64、72 h共10個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣，取發(fā)酵液4 mL于離心管中，10 000 r/min離心2 min，把上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中，保存于 -70 ℃冰箱待測。

1.2.2 生長曲線測定 接種后在發(fā)酵0、8、16、24、32、40、48、56、64、72 h共10個(gè)時(shí)間點(diǎn)，將培養(yǎng)液混勻后取10 μL用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行計(jì)數(shù)，每個(gè)時(shí)間做3次重復(fù)，取3次的平均值用于生長曲線的制作。

1.2.3 采用DNS法測定還原糖

1）制作葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線：分別配制4種糖濃度為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按表2中的濃度梯度加入試劑，然后將比色管放入沸水中加熱5 min，用冷水冷卻至室溫后加蒸餾水定容至25 mL，搖勻后在520 nm波長下測定吸光度[9]，并分別繪制出4種糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線。葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=1.633 9x+0.003 9，R2=0.999 8；木糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=1.599 9x+0.003 1，R2=0.999 7；阿拉伯糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=1.813 5x+0.012 7，R2=0.999 9；半乳糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=1.737 2x+0.011 3，R2=0.999 5。

2）發(fā)酵液中還原糖的測定：把樣品從冰箱中取出，解凍后充分搖勻，每個(gè)樣品取0.5 mL 置于容量瓶中加蒸餾水定容至50 mL，混勻后每管取2 mL放入比色管中，分別加入1.5 mL 的DNS 試劑，在沸水中加熱5 min，用冷水冷卻至室溫后加蒸餾水定容至25 mL，搖勻后在520 nm波長下測定吸光度，借鑒董林青等[9]的測定方法。

1.2.4 采用氣相色譜法測定乙醇產(chǎn)量

1）制作乙醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線。用水做溶劑配制不同濃度梯度的乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，乙醇的體積分?jǐn)?shù)分別為0.05%、0.50%、1.00%、1.50%、2.00%、3.00%、4.00%。用氣相色譜進(jìn)行測定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到乙醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=199.54x-2.650 4，R2=0.999 4。

氣相色譜條件[10，11]：色譜柱TG-624 （30 m × 0.25 mm ID， 1.4 μm Film）；柱溫70 ℃維持10 min；氣化室溫度200 ℃；FID檢測器溫度250 ℃；分流比為25∶1；載氣（N2）流速為1 mL/min；進(jìn)樣量為1 μL。

2）發(fā)酵液中乙醇含量的測定。樣品預(yù)處理[10]：把樣品從冰箱中取出，解凍后充分搖勻（部分樣品進(jìn)行適當(dāng)稀釋），取發(fā)酵液2 mL用0.22 μm微孔濾膜進(jìn)行過濾，然后進(jìn)行氣相色譜分析，氣相色譜條件與標(biāo)準(zhǔn)曲線制作時(shí)相同，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)樣品重復(fù)測定3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 畢赤酵母的生長曲線測定

畢赤酵母CBS 6054在5種不同的培養(yǎng)基中發(fā)酵72 h，繪制的生長曲線如圖1所示。不加糖的培養(yǎng)基中畢赤酵母CBS 6054濃度最低，在24 h達(dá)到最高值，菌液濃度為6.52×107 cells/mL（對數(shù)值為7.81）；木糖和葡萄糖培養(yǎng)基中畢赤酵母CBS 6054的生長曲線比較相似，在40 h達(dá)到穩(wěn)定期，菌液濃度分別為2.33×108 cells/mL（對數(shù)值為8.37），2.28×108 cells/mL（對數(shù)值為8.36）；阿拉伯糖培養(yǎng)基和半乳糖培養(yǎng)基中其生長曲線比較相似，最高菌液濃度分別為1.65×108 cells/mL（對數(shù)值為8.22），2.14×108 cells/mL（對數(shù)值為8.33）。總體來說，4種單糖培養(yǎng)基的菌體濃度差異不明顯。

2.2 畢赤酵母CBS 6054對4種糖的發(fā)酵情況

畢赤酵母CBS 6054在不同培養(yǎng)基中的發(fā)酵情況如圖2所示，通過DNS法測得的木糖和葡萄糖的最初濃度分別為78.95、77.28 mg/mL；阿拉伯糖和半乳糖的最初濃度分別為72.99、72.28 mg/mL。該菌株發(fā)酵木糖和葡萄糖的情況相當(dāng)，糖的濃度呈對數(shù)遞減，在48 h就將糖消耗完全；發(fā)酵半乳糖時(shí)糖的濃度呈線性遞減，在72 h糖濃度為11.14 mg/mL，該糖的利用率為90.9%；阿拉伯糖培養(yǎng)基在72 h糖濃度為58.32 mg/mL，該糖的利用率僅為21.6%。因此，畢赤酵母CBS 6054發(fā)酵木糖和葡萄糖的能力較強(qiáng)，且兩者發(fā)酵情況相當(dāng)；發(fā)酵半乳糖的能力適中；發(fā)酵阿拉伯糖的能力較弱。

2.3 畢赤酵母發(fā)酵4種糖的乙醇產(chǎn)量

圖3顯示的是不同單糖培養(yǎng)基發(fā)酵72 h時(shí)的氣相色譜圖，乙醇峰的保留時(shí)間是8.4 min左右，阿拉伯糖發(fā)酵幾乎未產(chǎn)生乙醇，生成了少量甲醇，甲醇峰的保留時(shí)間是7.1 min左右。畢赤酵母發(fā)酵葡萄糖和木糖時(shí)乙醇濃度均在48 h達(dá)到最大值，乙醇產(chǎn)率分別為0.477 4、0.396 8（乙醇∶消耗的糖，m∶m，下同）；發(fā)酵半乳糖時(shí)，在72 h乙醇產(chǎn)率可達(dá)0.339 5；發(fā)酵阿拉伯糖時(shí)幾乎未產(chǎn)生乙醇，生成了少量甲醇。該菌株不同時(shí)間點(diǎn)乙醇產(chǎn)量的變化情況見圖4。乙醇產(chǎn)量從高到低依次是葡萄糖、木糖、半乳糖，該菌株發(fā)酵葡萄糖的乙醇轉(zhuǎn)化率較高，達(dá)到理論值0.51[12]的93.6%。

3 小結(jié)與討論

本研究以畢赤酵母CBS 6054為試驗(yàn)菌株，測定畢赤酵母發(fā)酵不同單糖時(shí)的生長曲線、糖消耗情況、乙醇產(chǎn)物生成情況，由此研究該菌株發(fā)酵不同單糖的能力以及對應(yīng)的產(chǎn)乙醇的潛力。該菌株發(fā)酵木糖和葡萄糖的能力較強(qiáng)，且兩者發(fā)酵情況相當(dāng)；發(fā)酵半乳糖的能力適中；發(fā)酵阿拉伯糖的能力較弱。乙醇產(chǎn)量從高到低依次是葡萄糖、木糖、半乳糖，發(fā)酵阿拉伯糖時(shí)幾乎未產(chǎn)生乙醇，生成了少量甲醇。

畢赤酵母CBS 6054對于葡萄糖和木糖的發(fā)酵情況相當(dāng)，是因?yàn)槟咎潜晃蘸笙韧ㄟ^磷酸戊糖途徑進(jìn)行轉(zhuǎn)化，然后進(jìn)入糖酵解途徑與葡萄糖的發(fā)酵重合，最終生成乙醇。而且，該菌株發(fā)酵葡萄糖和木糖時(shí)乙醇的生成情況與糖消耗情況相吻合，說明發(fā)酵過程中糖主要轉(zhuǎn)變成了乙醇。研究結(jié)果顯示，該菌株既可以發(fā)酵葡萄糖，又可以發(fā)酵木糖和半乳糖，這有利于對木質(zhì)纖維素水解液中幾種糖分的充分利用。

有研究表明[13]，畢赤酵母CBS 6054發(fā)酵中，葡萄糖主要用于菌體生長，木糖主要用來合成乙醇。本研究也發(fā)現(xiàn)雖然畢赤酵母CBS 6054對阿拉伯糖利用率低，但菌體生長量與其他單糖相當(dāng)，表明阿拉伯糖可以促進(jìn)菌體的生長，但幾乎無乙醇產(chǎn)生。綜上所述，不同單糖被菌體吸收后進(jìn)入不同的通路，起到不同作用，若能充分發(fā)揮單糖各自的優(yōu)勢，將有助于降低燃料乙醇的成本，提高乙醇得率。除此之外，阿拉伯糖和木糖同為五碳糖，木糖發(fā)酵產(chǎn)生乙醇，但阿拉伯糖不產(chǎn)生乙醇；半乳糖的糖消耗呈線性遞減，乙醇生成呈線性遞增，這些現(xiàn)象都有待進(jìn)一步研究。

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