黃瓜內(nèi)生真菌對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)生防活性測(cè)定

摘要：為了明確黃瓜根結(jié)內(nèi)生真菌對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)（Meloidogyne incognita）的防效，采用菌株發(fā)酵液對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)進(jìn)行離體活性和盆栽防效測(cè)定，結(jié)果表明，菌株經(jīng)形態(tài)和18S rDNA鑒定為Plectosphaerella sp.，其發(fā)酵液對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)處理48 h的致死活性為93.73%；盆栽試驗(yàn)表明，Plectosphaerella sp.對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)的防效為56.1%。發(fā)酵液處理的黃瓜根系卵塊數(shù)量少于對(duì)照，土壤中根結(jié)線蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)數(shù)量也少于對(duì)照。總體來(lái)看，Plectosphaerella sp.對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)具有較高的生防活性，能為黃瓜根結(jié)線蟲(chóng)生物防治奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：黃瓜； 內(nèi)生真菌； 生物防治； 根結(jié)線蟲(chóng)（Meloidogyne incognita）

中圖分類(lèi)號(hào)：S432.4+4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）03-0634-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.03.022

Abstract： To assess bioncontrol activity against root knot nematode by an endophytic fungus isolated from cucumber root galls，the biocontrol potential of the fungus was analyzed through in vitro test and pot experiment. The fungus was identified as Plectosphaerella sp. according to morphological characteristics and 18S rDNA sequences. The fungal fermentation broth killed 93.73% of root knot nematode for 48 h. The control efficiency of Plectosphaerella sp. revealed by pot experiment was 56.1%. The number of egg mass on cucumber root and population of root knot nematode in soil treated by fungus were higher than that by control. In a conclusion，the fungus possessed high biocontrol activity against root knot nematode.

Key words： cucumber； endophytic fungus； biocontrol； Meloidogyne incognita

黃瓜是全世界范圍內(nèi)廣泛種植的一種蔬菜。中國(guó)黃瓜栽培面積占蔬菜總面積的10%左右，黃瓜設(shè)施栽培占黃瓜總面積的80%。根結(jié)線蟲(chóng)病是黃瓜生產(chǎn)中的重要病害，特別在設(shè)施栽培環(huán)境中，高溫、高濕以及常年連作為根結(jié)線蟲(chóng)的發(fā)生提供了有利條件。目前使用最廣泛的防治方法是施用化學(xué)殺線劑，但化學(xué)殺線劑帶來(lái)的環(huán)境、毒性等問(wèn)題，給蔬菜安全生產(chǎn)提出了新的要求。

生物防治是綠色環(huán)保的防治手段，其中內(nèi)生真菌防治植物寄生線蟲(chóng)最具有發(fā)展?jié)摿Α７迅績(jī)?nèi)生尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）菌株能使南方根結(jié)線蟲(chóng)的侵染率降低55%[1]，而從香蕉上分離到的內(nèi)生鐮刀菌使香蕉穿孔線蟲(chóng)（Radopholus similis）的抑制率達(dá)到了39%～85%[2]。根結(jié)線蟲(chóng)生防菌（Paecilomyces lilacinus） Strain 251能夠減少番茄66%的根結(jié)數(shù)量、74%的卵塊數(shù)量和土壤中71%的線蟲(chóng)數(shù)量[3]。黃瓜根結(jié)線蟲(chóng)生物防治應(yīng)用較多的是菌根真菌，如Glomus intraradices，G. mosseae和G. versiforme等[4]，以及尖孢鐮刀菌Fo47和CS-20[5]，它們能夠誘導(dǎo)黃瓜產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性，抵抗根結(jié)線蟲(chóng)侵染。這些真菌均分離于健康的植物組織，在應(yīng)用過(guò)程中真菌并未定植在根結(jié)部位，并未充分發(fā)揮防效。從發(fā)病組織能夠分離到相應(yīng)病原菌的生防微生物，田雪亮等[6]從番茄根結(jié)中分離到一株對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)具有良好防效的內(nèi)生真菌交織枝頂孢（Acremonium implicatum）。

本研究從根結(jié)線蟲(chóng)重病田種植的黃瓜根結(jié)中分離到一株內(nèi)生真菌，并對(duì)其進(jìn)行了抑制根結(jié)線蟲(chóng)活性測(cè)定和盆栽試驗(yàn)測(cè)定，以期為根結(jié)線蟲(chóng)生物防治開(kāi)發(fā)新途徑。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

黃瓜根結(jié)樣品采集于溫室大棚，該棚種植黃瓜多年，且根結(jié)線蟲(chóng)發(fā)病較重。選取10株發(fā)病較重、根結(jié)較大的黃瓜，抖落根系泥土，將根結(jié)帶回實(shí)驗(yàn)室備用。

1.2 黃瓜根結(jié)內(nèi)生真菌分離

選擇直徑1.0 cm，未腐爛的根結(jié)，用自來(lái)水沖洗根結(jié)表面泥土，無(wú)菌刀片削掉根結(jié)表皮，然后在75%乙醇中浸泡1 min，轉(zhuǎn)入1%次氯酸鈉溶液中浸泡3 min，最后用無(wú)菌水沖洗3次。在無(wú)菌條件下將根結(jié)切成直徑0.5 cm的組織塊，擺放于PDA平板（含40 μg/mL的氨芐青霉素），置于25 ℃恒溫箱培養(yǎng)，待菌落長(zhǎng)出后，挑取菌絲到新的PDA平板上進(jìn)行純化。

1.3 菌株分子鑒定

取0.2～0.5 g菌絲用于基因組DNA的提取，參考Al-Samarrai等[7]方法并稍作修改，將DNA稀釋至100 μg/μL，-20 ℃保存?zhèn)溆?。采?8S rDNA通用引物NS17UCB，5′-CATGT CTAAG TTTAA GCAA-3′；NS18UCB，5′-CTCAT TCCAA TTACA -3′[8]擴(kuò)增真菌的18S rDNA區(qū)域。PCR反應(yīng)體系：10×Buffer 2 μL，dNTPs （5 mmol/L） 1.2 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1 μL，模板1.5 μL，Taq DNA聚合酶0.3 μL，用ddH2O補(bǔ)足20 μL體系。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共31個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，16 ℃保溫2 h。PCR產(chǎn)物測(cè)序所得序列，登陸NCBI進(jìn)行BLAST比對(duì)，下載與真菌相似度高的其他真菌18S rDNA序列，采用MEGA4.0軟件以鄰接法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)[9]。

1.4 菌株對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)致死活性測(cè)定

挑取菌株菌絲接入含有PDB培養(yǎng)液的三角瓶中，25 ℃，110 r/min振蕩培養(yǎng)7 d，即得到發(fā)酵液。將菌株發(fā)酵液經(jīng)細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾和高溫滅菌處理，得到原液和滅菌發(fā)酵液，進(jìn)行殺根結(jié)線蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)的活性檢測(cè)。分別取4 mL發(fā)酵原液和高溫滅菌發(fā)酵液置于培養(yǎng)皿，然后加入約100條根結(jié)線蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)，置于25 ℃條件下培養(yǎng)24、48 h。將所有線蟲(chóng)在清水中恢復(fù)2 h，不活動(dòng)的線蟲(chóng)記為死亡[10]。統(tǒng)計(jì)線蟲(chóng)死亡數(shù)量，計(jì)算校正死亡率。以無(wú)菌水為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)5次。

校正死亡率=（處理死亡率-對(duì)照死亡率） /（1-對(duì)照死亡率）×100%

1.5 盆栽防效測(cè)定

黃瓜種子經(jīng)過(guò)70%乙醇表面消毒以后，種植于苗盤(pán)內(nèi)。待黃瓜長(zhǎng)至三葉期，輕輕拔出黃瓜苗，浸在培養(yǎng)7 d的菌株發(fā)酵液內(nèi)20 s，然后種植于無(wú)菌草炭土內(nèi)，生長(zhǎng)7 d后接種5 mL根結(jié)線蟲(chóng)懸浮液（含約1 000條2齡幼蟲(chóng)），處理10株，以無(wú)菌水為對(duì)照，重復(fù)3次。在生長(zhǎng)期間進(jìn)行正常管理，接種30 d以后，調(diào)查根結(jié)線蟲(chóng)情況。用清水將根系沖洗干凈后調(diào)查并統(tǒng)計(jì)根結(jié)線蟲(chóng)數(shù)量，計(jì)算防治效果[11]。

盆栽防效=[（對(duì)照根結(jié)數(shù)-處理根結(jié)數(shù)）/對(duì)照根結(jié)數(shù)]×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株物種鑒定

在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)7 d后，菌落直徑為4 cm左右。菌落白色，呈絨毛狀。分生孢子橢圓形或長(zhǎng)橢圓形，長(zhǎng)5.4～5.8 μm，寬2.2～2.8 μm。分生孢子有膈膜，多胞（圖1）。

分離菌株在進(jìn)化樹(shù)上與Plectosphaerella sp.位于同一進(jìn)化分支，且相似度為100，表明菌株與Plectosphaerella sp.親緣關(guān)系近。結(jié)合菌株的形態(tài)特征，將菌株鑒定為Plectosphaerella sp.。由于未獲得具體物種名，將其暫命名為Strain 12（圖2）。

2.2 菌株發(fā)酵液對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)的致死活性

由圖3可以看出，根結(jié)線蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)經(jīng)菌株發(fā)酵液處理時(shí)間越長(zhǎng)，線蟲(chóng)死亡率就越高，48 h處理線蟲(chóng)死亡率高于24 h處理。菌株發(fā)酵原液處理根結(jié)線蟲(chóng)24、48 h，線蟲(chóng)校正死亡率為93.07%和93.73%，高于高溫滅菌發(fā)酵液對(duì)線蟲(chóng)的校正死亡率87.98%和90.53%。高溫滅菌可能對(duì)發(fā)酵液某些物質(zhì)產(chǎn)生影響，造成線蟲(chóng)校正死亡率稍微降低，但主要的殺線蟲(chóng)物質(zhì)的活性并未喪失，表明該物質(zhì)具有較高的熱穩(wěn)定性。

2.3 菌株對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)的盆栽防效測(cè)定

從圖4A看出，菌株發(fā)酵液處理黃瓜的根結(jié)線蟲(chóng)數(shù)量為61.3個(gè)，而對(duì)照處理的黃瓜根結(jié)數(shù)量為139.7個(gè)，差異顯著（P<0.05）。根據(jù)公式計(jì)算，發(fā)酵液的防效為56.10%。菌株發(fā)酵液處理的黃瓜根系上根結(jié)線蟲(chóng)卵塊數(shù)量為17個(gè)，而對(duì)照黃瓜根系卵塊數(shù)量為53個(gè)，差異顯著（P<0.05）（圖4B）。此外，發(fā)酵液處理后，土壤中根結(jié)線蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)數(shù)量為69.7頭，而對(duì)照土壤中根結(jié)線蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)數(shù)量為325.3頭，顯著高于發(fā)酵液處理（圖4C）。經(jīng)發(fā)酵液處理后，黃瓜的根系較發(fā)達(dá)，根結(jié)數(shù)量少且小。

3 小結(jié)與討論

內(nèi)生真菌普遍存在于植物體內(nèi)，能夠產(chǎn)生次生代謝物質(zhì)保護(hù)植物或調(diào)解植物生長(zhǎng)，甚至抵抗某些植物病原物的侵染，是一類(lèi)非常有潛力的生防微生物。植物病原物的侵染能夠改變植物內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)，如根結(jié)線蟲(chóng)侵染能夠誘導(dǎo)植物內(nèi)生真菌種類(lèi)改變，誘導(dǎo)某些對(duì)線蟲(chóng)有生防活性的真菌在根結(jié)部位定殖[12]，從而起到保護(hù)植物的作用。因此，從植物根結(jié)組織中能夠分離到對(duì)線蟲(chóng)生防活性較高的內(nèi)生真菌。

筆直枝頂孢（Acremonium strictum）[13]和交織枝頂孢（A. implicatum）[5]分離于番茄根結(jié)，具有殺線蟲(chóng)活性、卵孵化抑制活性和卵寄生活性，對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)防治效果較好。本研究Plectosphaerella sp.分離于黃瓜根結(jié)，對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)具有較高的致死活性，其發(fā)酵液對(duì)線蟲(chóng)校正死亡率為93.73%，稍低于交織枝頂孢的96.00%。此外，Plectosphaerella sp.盆栽防效為56.10%，也低于交織枝頂孢的66.70%，與非致病性尖孢鐮刀菌Fo47和CS-20防效相當(dāng)，具有應(yīng)用價(jià)值。

相對(duì)于其他生防微生物，利用內(nèi)生真菌防治線蟲(chóng)具有3方面優(yōu)勢(shì)。首先，內(nèi)生真菌與植物線蟲(chóng)具有相似的生態(tài)位點(diǎn)，充分發(fā)揮其拮抗作用；其次，內(nèi)生真菌大部分生活史在植物體內(nèi)完成，其生存和繁殖受外部環(huán)境影響較小，避免了與土壤其他微生物之間的強(qiáng)烈競(jìng)爭(zhēng)；再次，大部分內(nèi)生真菌可以離體培養(yǎng)，具有大規(guī)模工廠化生產(chǎn)的可行性，能夠開(kāi)發(fā)生防菌劑[14]。本研究中，黃瓜根結(jié)經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的表面消毒，因此分離的真菌Plectosphaerella sp.為黃瓜內(nèi)生真菌。內(nèi)生真菌克服了普通生防菌難以在土壤中定殖的問(wèn)題，能夠在植物組織內(nèi)持續(xù)發(fā)揮拮抗線蟲(chóng)的作用，因此具有較高的防治效果，是最具前景的生防資源[15]。

下一步研究工作將集中于分離并鑒定對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)具有生防活性的物質(zhì)，為研制新型、環(huán)境友好型的殺線微生物源農(nóng)藥提供技術(shù)支撐。

參考文獻(xiàn)：

[1] STIRLING G R，GRIFFIN D，OPHEL-KELLER K，et al. Combining an initial risk assessment process with DNA assays to improve prediction of soilborne diseases caused by root-knot nematode （Meloidogyne spp.） and Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici in the Queensland tomato industry[J].Australasian Plant Pathology，2004，33（2）：285-293.

[2] VU T T T，HAUSCHILD R，SIKORA R A. Fusarium oxysporum endophytes induced systemic resistance against Radopholus similis on banana[J]. Nematology，2006，8（6）：847-852.

[3] KIEWNICK S，SIKORA R A. Biological control of the root-knot nematode Meloidogyne incognita by Paecilomyces lilacinus strain 251[J].Biological Control，2006，38（2）：179-187.

[4] ZHANG L D，ZHANG J L，CHRISTIE P，et al. Pre-inoculation with arbuscular mycorrhizal fungi suppresses root knot nematode （Meloidogyne incognita） on cucumber （Cucumis sativus）[J]. Biology and Fertility of Soils，2008，45（2）：205-211.

[5] FRAVEL D R，OLIVAIN C，ALABOUVETTE C. Fusarium oxysporum and its biocontrol[J].New Phytologist，2003，157（3）：493-502.

[6] TIAN X L，YAO Y R，CHEN G H，et al. Suppression of Meloidogyne incognita by the endophytic fungus Acremonium implicatum from tomato root galls[J]. International Journal of Pest Management，2014，60（4）：239-245.

[7] AL-SAMARRAI T H，SCHMID J. A simple method for extraction of fungal genomic DNA[J]. Letters in Applied Microbiology，2000，30（1）：53-56.

[8] GARGAS A，TAYLOR J W. Polymerase chain reaction （PCR） primers for amplifying and sequencing nuclear 18S rDNA from lichenized fungi[J]. Mycologia，1992，84：589-592.

[9] TAMURA K，DUDLEY J，NEI M，et al. MEGA4：Molecular evolutionary genetics analysis（MEGA）[J]. Molecular Biology and Evolution，2007，24（8）：1596-1599.

[10] 王 剛，李二峰，茆振川，等.尖孢鐮刀菌CuO2對(duì)黃瓜的致病性及防治根結(jié)線蟲(chóng)的效果[J].中國(guó)蔬菜，2012，1（4）：31-36.

[11] 馬金慧，朱萍萍，茆振川，等.哈茨木霉菌株TRI2的鑒定及其對(duì)黃瓜根結(jié)線蟲(chóng)的防治作用[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2014，30（22）：263-269.

[12] ALGUACIL M M，TORRECILLAS E，LOZANO Z，et al. Evidence of differences between the communities of arbuscular mycorrhizal fungi colonizing galls and roots of Prunus persica infected by the root-knot nematode Meloidogyne incognita[J].Applied and Environmental Microbiology，2011，77（24）：8656-8661.

[13] GOSWAMI J，PANDEY R K，TEWARI J. Management of root knot nematode on tomato through application of fungal antagonists，Acremonium strictum and Trichoderma harzianum[J].Journal of Environmental Science and Health Part B，2008，43：237-240.

[14] OWNLEY B H，GWINN K D，VEGA F E. Endophytic fungal entomopathogens with activity against plant pathogens： Ecology and evolution[J].Bio Control，2010，55（1）：113-128.

[15] SCHULZ B，BOYLE C，DRAEGER S，et al. Endophytic fungi： A source of novel biologically active secondary metabolites[J]. Mycological Research，2002，106（9）：996-1004.