銀杏葉片愈傷組織誘導的激素組合培養(yǎng)條件分析

摘要：以銀杏（Ginkgo biloba L.）葉片外植體為試材，研究了不同激素組合培養(yǎng)條件對銀杏葉片外植體脫分化誘導愈傷組織的效果。結(jié)果表明，不同激素組合培養(yǎng)條件對銀杏葉片外植體啟動脫分化（膨大）的效應極顯著，且膨大率與膨大速度之間具有良好的一致性；不同培養(yǎng)條件對銀杏葉片外植體愈傷組織誘導形成的效應極顯著，且愈傷組織的誘導率與誘導速度之間具有較好的協(xié)同性；綜合各項測量指標，當培養(yǎng)基中激素組合為MS+2.0 mg/L 2，4-D +1.0 mg/L NAA +0.3 mg/L 6-BA +1.0 mg/L KT時，銀杏葉片誘導愈傷組織誘導效果相對最佳。

關(guān)鍵詞：銀杏（Ginkgo biloba L.）；葉片；膨大；愈傷誘導；培養(yǎng)條件

中圖分類號：R282 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）01-0216-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.01.057

銀杏（Ginkgo biloba L.）為銀杏科銀杏屬落葉喬木，又名白果、公孫樹、鴨腳樹、蒲扇，是新生代第四紀冰川期的孑遺植物，素有裸子植物“活化石”之稱，為中國獨存的珍稀名貴樹種[1]。銀杏葉中含有黃酮類化合物和萜內(nèi)酯類化合物等多種生理活性物質(zhì)，具有擴張血管、增加血流量、改善血液循環(huán)、降低腦血管阻力、抑制血栓形成、改善腦細胞代謝水平等作用[2-4]，已經(jīng)在食品、保健、醫(yī)藥等領(lǐng)域得到廣泛開發(fā)利用。目前，利用銀杏愈傷組織的細胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)黃酮類次生代謝產(chǎn)物成為近年來發(fā)展的新領(lǐng)域[5-7]，但是由于銀杏初始愈傷組織的品質(zhì)與特性差異，往往造成生產(chǎn)量偏低，很難滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需要。目前，許多研究者從不同側(cè)面探索銀杏離體培養(yǎng)中培養(yǎng)基類型、激素、培養(yǎng)條件及其他相關(guān)因素對銀杏愈傷誘導的影響[8-11]。本研究以銀杏葉片為試材，以2，4-D、NAA、6-BA與KT 4種激素為效應變量，分析不同激素組合培養(yǎng)條件對銀杏葉片外植體啟動脫分化與愈傷誘導的效應方式與效應大小，為進一步優(yōu)化銀杏愈傷組織培養(yǎng)條件，提高銀杏愈傷組織誘導效率，促進其大規(guī)模細胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)有效次生代謝產(chǎn)物提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

取陜西理工學院校園內(nèi)一株約10年生銀杏樹干萌發(fā)的幼嫩枝條上的新鮮葉片作為試驗材料。試驗用NAA（α-奈乙酸）、6-BA（6-芐基腺嘌呤）、2， 4-D（2，4-二氯苯氧乙酸）與KT（呋喃氨基嘌呤）均為分析純；培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗材料預處理 選擇顏色鮮綠、完整健康、大小一致的銀杏葉片，用紗布擦掉表面灰塵，然后用自來水沖洗表面的雜質(zhì)1～2 h，在超凈工作臺采用乙醇-升汞配合消毒。將試材裝入消毒好的廣口瓶中，首先用75%乙醇表面消毒30 s，再用0.1%升汞（HgCl2）浸泡10 min，處理過程中不斷搖動，保證消毒液與葉片充分接觸，然后用無菌蒸餾水沖洗5～6次，每次2～3 min，放置于無菌濾紙上吸干水分。無菌操作條件下用解剖刀將銀杏葉片切分為長寬約0.5 cm的小塊，接種至不同組合的誘導培養(yǎng)基。

1.2.2 培養(yǎng)基配制 在MS培養(yǎng)基中加入不同劑量的NAA、6-BA、2，4-D與KT 4種激素，配制成試驗所需的培養(yǎng)基（表1），各培養(yǎng)基中均按3.0%的濃度加入蔗糖，按0.6%的濃度加入瓊脂粉，調(diào)整pH為5.8～6.0，在121 ℃、1.3～1.5大氣壓下滅菌20 min，備用。

1.2.3 材料處理與誘導 無菌操作條件下，將預先準備好的銀杏葉片外植體，分別接種至Ⅰ～Ⅸ培養(yǎng)基中，放置于溫度（25±2） ℃，相對濕度50%～60%，黑暗培養(yǎng)30 d，觀察愈傷組織的形態(tài)、顏色、質(zhì)地及生長情況，定期統(tǒng)計各處理中體積明顯膨大的外植體數(shù)與誘導出愈的外植體數(shù)，并依此計算出相應的二級變量。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 接種10 d后，去除污染與壞死材料，統(tǒng)計無菌外植體數(shù)，視為接種外植體總數(shù)。依據(jù)定期統(tǒng)計的膨大數(shù)、出愈數(shù)計算出膨大率、膨大速度、誘導率與誘導速度。計算公式如下：

膨大率=膨大外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)×100%

膨大速度=（WN-WM）/[（N-M）×Y]

誘導率=誘導出愈傷組織的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)×100%

誘導速度=（ZN-ZM）/[（N-M）×K]

式中，WN代表第N天膨大的外植體數(shù)，WM代表第M天膨大的外植體數(shù)，K代表接種外植體總數(shù)，ZN代表第N天出愈的外植體數(shù)，ZM代表第M天出愈的外植體數(shù)。

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，對試驗數(shù)據(jù)進行one-way ANOVA分析，研究不同培養(yǎng)條件對銀杏葉片愈傷組織誘導的效應。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)條件下銀杏葉片愈傷誘導的基本情況

將銀杏葉片外植體接種至試驗設計的9種培養(yǎng)基中，第三天左右各處理外植體顏色明顯加深，由原來的嫩綠色變?yōu)樯罹G色，第七天外植體明顯膨大，邊角增厚向內(nèi)卷曲，體積增加，在切口處及外植體表面產(chǎn)生少量淡黃色顆粒狀突起。第十天各處理培養(yǎng)基中外植體表面形成一薄層愈傷組織，最初為白色或淡黃色顆粒狀，質(zhì)地比較致密，隨著培養(yǎng)時間的延長，愈傷細胞不斷分裂生長，外植體整個表面都被愈傷組織所覆蓋，愈傷顏色加深，多為黃綠色或綠色，質(zhì)地疏松或致密。不同激素組合處理對銀杏葉片愈傷組織誘導均有效果。激素組合配比方式不同，外植體的膨大頻率與愈傷誘導頻率存在明顯差異，愈傷組織的顏色、質(zhì)地及愈傷生長情況也不盡相同（表2）。

2.2 不同培養(yǎng)條件對銀杏葉片外植體膨大的效應

以不同激素組合培養(yǎng)條件為自變量，分別以膨大率與膨大速度為因變量作單因素方差分析，統(tǒng)計分析結(jié)果見表3。單因素方差分析結(jié)果表明，不同激素組合條件對銀杏葉片外植體啟動脫分化的效應極顯著（F=48.465，P<0.01），即在不同激素組合配比條件下，銀杏葉片外植體的膨大率存在明顯差異。從各處理的培養(yǎng)效果對比分析（圖1），Ⅳ處理條件下銀杏葉片外植體膨大效果最為理想，可以達到外植體的完全脫分化，即膨大率為100.00%；Ⅷ處理次之，膨大率達96.00%，Ⅶ處理培養(yǎng)效果最差，膨大率僅為13.79%。不同激素組合培養(yǎng)條件對銀杏葉片膨大速度這個因變量，也同樣表現(xiàn)出類似的顯著性效應（F=7.342，P<0.01）。其中Ⅳ處理的膨大速度相對最快（0.043 9個/d），Ⅴ處理次之，Ⅰ處理與Ⅴ處理膨大速度基本相當，Ⅶ處理膨大速度相對最慢，僅為0.005 3個/d。綜合直觀分析（圖1、圖2）與方差分析結(jié)果可以看出，銀杏葉片外植體啟動脫分化（膨大）的靜態(tài)指標（膨大率）與動態(tài)指標（膨大速度）之間表現(xiàn)出良好的一致性。Ⅳ處理膨大率和膨大速度均為最大值，而Ⅶ處理膨大率和膨大速度則處于相對較低的水平。

2.3 不同培養(yǎng)條件對銀杏葉片外植體出愈的效應

誘導率作為衡量外植體出愈效果的一項重要指標，它能夠從量化角度評價愈傷組織發(fā)生的最佳條件，誘導速度則從動態(tài)變化的角度來衡量外植體愈傷發(fā)生與積累的快慢程度。以不同激素組合培養(yǎng)條件為自變量，以愈傷誘導率與誘導速度為因變量進行單因素方差分析，結(jié)果如表4所示。

由單因素方差分析可知，不同激素組合培養(yǎng)條件對銀杏葉片外植體誘導率與誘導速度的效應均為極顯著（F=71.509，P<0.01；F=48.008，P<0.01），圖3、圖4則比較直觀地反映出不同激素組合配比對銀杏葉片外植體愈傷誘導的差異性。從誘導的總體效果分析，除Ⅶ號處理外，其他各激素組合處理中銀杏葉片外植體的愈傷組織誘導率均在80%以上，保持在一個相對較高的誘導水平。由此可見，銀杏葉片外植體細胞生理活性較強，比較容易脫分化誘導出愈傷組織，因而是愈傷組織誘導的良好材料。另外，從愈傷誘導指標的協(xié)同性方面分析，以動態(tài)變化為主要特征的誘導速度與以宏觀靜態(tài)為主要特征的愈傷誘導率之間，在誘導效果趨勢上表現(xiàn)出良好的協(xié)同一致性。Ⅳ處理愈傷誘導效果非常明顯，所有外植體均有效脫分化形成愈傷組織，誘導率最高達到100.00%，誘導速度為0.041 1個/d，表現(xiàn)出相應的高水平狀態(tài)。

3 小結(jié)與討論

研究報道愈傷組織的形成和生長是受多種因素的影響，其中激素對植物離體培養(yǎng)中的細胞分化和形態(tài)建成具有明顯的調(diào)節(jié)作用[12]。植物激素對植物離體培養(yǎng)具有非常重要的調(diào)控作用，是愈傷組織誘導的主導因素，選擇合適的激素種類和濃度是愈傷組織誘導和生長的關(guān)鍵因素[13]。植物組織培養(yǎng)過程中，激素種類、濃度及其配比對于協(xié)調(diào)細胞生長、分化和代謝起重要作用。本研究以2，4-D、NAA、6-BA與KT 4種激素相互配比組合，形成多元化激素組合誘導培養(yǎng)條件，分析不同培養(yǎng)條件對銀杏葉片外植體脫分化誘導愈傷組織的效應大小與效應方式。結(jié)果表明，不同激素組合培養(yǎng)條件對銀杏葉片外植體離體培養(yǎng)中膨大率、膨大速度、愈傷誘導率與誘導速度4個因變量的效應均為極顯著，這種激素組合配比對外植體啟動脫分化（膨大）與愈傷誘導效果的差異性分化，為銀杏葉片外植體愈傷組織誘導中最佳激素組配方式的篩選提供了前提。

綜合分析各效應指標，對于膨大率而言，Ⅳ處理和Ⅷ號表現(xiàn)出較優(yōu)的誘導效果，而對于膨大速度而言Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ處理之間基本持平，外植體啟動脫分化速度相對較快；對于誘導率效應指標，Ⅳ處理所有外植體全部出愈，愈傷誘導率最高；且Ⅰ與Ⅳ處理在誘導速度變量上表現(xiàn)出相對優(yōu)勢，誘導速度較快，其余各組相對較慢。對比各處理誘導效果可知，對于處理Ⅶ而言，在試驗測量的4個效應指標上均處于低水平狀態(tài)，可見此處理并不利于銀杏葉片外植體愈傷組織的誘導。綜合分析各激素組合處理的愈傷誘導率與速度，結(jié)合愈傷組織的品質(zhì)與生長積累量狀態(tài)，可以看出處理Ⅳ在各因變量指標上均表現(xiàn)出高效應，是銀杏葉片愈傷誘導的理想條件，即當培養(yǎng)中激素組合培養(yǎng)條件為MS+2.0 mg/L 2，4-D +1.0 mg/L NAA +0.3 mg/L 6-BA +1.0 mg/L KT時，銀杏葉片外植體脫分化誘導愈傷組織效果相對最佳。

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