寬葉獨(dú)行菜組培體系的建立和初步優(yōu)化

摘要：以寬葉獨(dú)行菜（Lepidium latifolium L.）的葉片和莖段為外植體，接種于MS培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷誘導(dǎo)和植株再生培養(yǎng)，研究不同濃度激素對(duì)愈傷和再生苗生長狀況的影響。結(jié)果表明，當(dāng)激素濃度為1.5 mg/L 2，4-D +1.0 mg/L IAA +0.5 mg/L 6-BA時(shí)，再生植株長勢(shì)最好；當(dāng)激素濃度為0.5 mg/L 2，4-D +1.0 mg/L IAA +1.5 mg/L 6-BA時(shí)愈傷組織長勢(shì)最好；適當(dāng)增加6-BA的濃度，可以促進(jìn)再生植株根系的生長。

關(guān)鍵詞：寬葉獨(dú)行菜（Lepidium latifolium L.）；組織培養(yǎng)；愈傷組織；外植體

中圖分類號(hào)：Q813.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）01-0213-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.01.056

寬葉獨(dú)行菜（Lepidium latifolium L.）為十字花科獨(dú)行菜族多年生草本植物，廣泛分布于中國北方的濱海及內(nèi)陸的鹽堿土上。該植物抗逆性強(qiáng)[1]，生長旺盛，是油菜進(jìn)行抗逆育種的寶貴的遺傳資源[2-4]，也是一種極具開發(fā)前景的資源植物[5]。本研究對(duì)寬葉獨(dú)行菜進(jìn)行組織培養(yǎng)并對(duì)組培體系進(jìn)行初步優(yōu)化，以期為寬葉獨(dú)行菜的原生質(zhì)體培養(yǎng)、遺傳轉(zhuǎn)化以及綜合利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

寬葉獨(dú)行菜，采自唐山地區(qū)。

1.2 培養(yǎng)基

以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基。

1.3 方法

1.3.1 外植體消毒與接種 采集寬葉獨(dú)行菜的幼葉和嫩莖，用自來水沖洗，洗衣粉浸泡2～3 min，再用自來水沖洗干凈，置于超凈工作臺(tái)上進(jìn)行常規(guī)消毒。先用1%的HCl2溶液浸泡5 min，無菌水沖洗2次，再用70%的乙醇浸泡0.5 min，無菌水沖洗2次，脫脂棉擦干備用。將寬葉獨(dú)行菜幼葉切成0.5 cm2大小的片段，嫩莖切成0.5～1.0 cm的小段，作為愈傷組織誘導(dǎo)的外植體接種于盛有無菌培養(yǎng)基的三角瓶中。

1.3.2 2，4-D對(duì)寬葉獨(dú)行菜組培特性的影響 1～5號(hào)培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加入3種外源激素2，4-D、IAA和6-BA，具體構(gòu)成如表1所示，其中IAA為1.0 mg/L，6-BA為0.5 mg/L，2，4-D為0.5～2.5 mg/L。每種培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌后，分裝在4個(gè)三角瓶中，冷卻后每個(gè)三角瓶接種3～4個(gè)外植體。

1.3.3 6-BA對(duì)寬葉獨(dú)行菜組培特性的影響 6～10號(hào)培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加入3種外源激素6-BA、IAA和2，4-D，具體構(gòu)成如表2所示，其中IAA為1.0 mg/L，2，4-D為0.5 mg/L，6-BA為0.5～2.5 mg/L。每種培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌后，分裝在4個(gè)三角瓶中，冷卻后每個(gè)三角瓶接種3～4個(gè)外植體。

1.3.4 愈傷培養(yǎng)及植株再生 將接種有外植體的三角瓶置于溫度（25±2） ℃，光照度1 800～2 000 lx，光照時(shí)間12 h，空氣相對(duì)濕度40%～60%的條件下培養(yǎng)。每天觀察1次。

2 結(jié)果與分析

2.1 2，4-D對(duì)寬葉獨(dú)行菜組培特性的影響

不同濃度2，4-D對(duì)寬葉獨(dú)行菜愈傷組織的誘導(dǎo)情況如表1所示。當(dāng)2，4-D濃度為0.5～1.0 mg/L時(shí)，愈傷組織白、軟。當(dāng)2，4-D為1.5 mg/L時(shí)，愈傷組織長勢(shì)最好，寬葉獨(dú)行菜愈傷組織黃、軟，體量大。之后，隨著2，4-D濃度的增加，愈傷組織顏色變深，質(zhì)地變硬，長勢(shì)變差。

接種7 d之后，進(jìn)入誘導(dǎo)期，接種的寬葉獨(dú)行菜葉片和莖段出現(xiàn)暗紅以及黃褐色（圖1a）。18 d后，外植體邊緣出現(xiàn)少量的愈傷組織（圖1b）。之后愈傷組織逐漸變大，并逐漸出現(xiàn)綠色小葉。24 d時(shí)，出現(xiàn)根系。35 d后，形成再生植株（圖1c）。1～5號(hào)培養(yǎng)基中寬葉獨(dú)行菜愈傷組織長出幼芽的時(shí)間逐漸變短，1號(hào)培養(yǎng)基中所需時(shí)間最長；3號(hào)和4號(hào)培養(yǎng)基中所需的時(shí)間最短，但4號(hào)培養(yǎng)基中的幼芽形態(tài)上沒有3號(hào)培養(yǎng)基中的表現(xiàn)好；5號(hào)培養(yǎng)基中幼芽長勢(shì)緩慢，基本處于停頓狀態(tài)。

2.2 6-BA對(duì)寬葉獨(dú)行菜組培特性的影響

不同濃度6-BA對(duì)寬葉獨(dú)行菜愈傷組織的誘導(dǎo)情況如表2所示。6號(hào)培養(yǎng)基與1號(hào)培養(yǎng)基激素構(gòu)成相同，所以當(dāng)6-BA濃度為0.5 mg/L時(shí)，寬葉獨(dú)行菜愈傷組織的表現(xiàn)和1號(hào)培養(yǎng)基中愈傷組織的表現(xiàn)相同。7號(hào)培養(yǎng)基中的愈傷組織與6號(hào)培養(yǎng)基中的愈傷組織表現(xiàn)相近，但長勢(shì)略好。當(dāng)6-BA為1.5 mg/L時(shí)，愈傷組織長勢(shì)最好，愈傷組織為淺黃色、軟、體量大。隨著6-BA濃度增加，9號(hào)和10號(hào)培養(yǎng)基中愈傷組織顏色逐級(jí)變深，質(zhì)地變硬，長勢(shì)變差。

寬葉獨(dú)行菜接種7 d之后，進(jìn)入誘導(dǎo)期，接種的葉片和莖段出現(xiàn)暗紅以及黃褐色。18 d后，外植體邊緣出現(xiàn)少量的愈傷組織并伴隨有白色根須出現(xiàn)（圖2a）。之后寬葉獨(dú)行菜愈傷組織逐漸變大并出現(xiàn)綠色小葉，根系也更加明顯。35 d后，再生植株形成，可以明顯看出6-BA濃度較高時(shí)再生株的根系較為發(fā)達(dá)（圖2b、圖2c）。隨著6-BA濃度的增加，愈傷組織誘導(dǎo)出芽的速度也呈上升趨勢(shì)。6～10號(hào)培養(yǎng)基出芽時(shí)間呈遞減趨勢(shì)，但幼芽長勢(shì)上卻表現(xiàn)出不同，8號(hào)培養(yǎng)基中的幼芽長勢(shì)最好。

3 小結(jié)與討論

3.1 外植體的選擇

在寬葉獨(dú)行菜組培體系的建立中選擇了幼葉和嫩莖作為外植體，二者均經(jīng)過相同條件的消毒，但在之后的無菌培養(yǎng)過程中，嫩莖的污染率達(dá)到了18.8%，而幼葉的污染率僅有3.8%，二者差異明顯，可以排除是無菌操作過程中的污染造成的。初步懷疑是寬葉獨(dú)行菜莖中的內(nèi)生菌引起的污染。因?yàn)閷捜~獨(dú)行菜是多年生植物，內(nèi)生菌易于積累[6]。所以在材料充足的條件下，應(yīng)盡可能采用寬葉獨(dú)行菜的幼葉來進(jìn)行組織培養(yǎng)，以減少內(nèi)生菌的污染。

3.2 激素濃度的選擇

作為一種細(xì)胞分裂素，6-BA主要是促進(jìn)芽的發(fā)育[7]。但試驗(yàn)中隨著6-BA濃度的增加，愈傷組織及再生植株的根系卻更加發(fā)達(dá)?？赡苁且?yàn)樵囼?yàn)中細(xì)胞分裂素與生長素之間的比例比較適合愈傷組織及再生植株根系的誘導(dǎo)生長。也有報(bào)道使用6-BA可以增加水稻不定根的數(shù)量[8]，增加玉米和黃瓜的根系生長量[9，10]。

以寬葉獨(dú)行菜愈傷組織和幼芽生長狀況來看，3號(hào)和8號(hào)培養(yǎng)基為最適培養(yǎng)基。但8號(hào)培養(yǎng)基中的根系過于旺盛，3號(hào)培養(yǎng)基中的再生植株幼芽和根系的形態(tài)適宜。所以試驗(yàn)中寬葉獨(dú)行菜組培體系的最適激素濃度為1.5 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L IAA+0.5 mg/L 6-BA。

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