高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定獸藥制劑中的金剛烷胺

摘要：根據(jù)金剛烷胺的化學(xué)性質(zhì)，結(jié)合已有提取方法與儀器公司給予的技術(shù)參考，采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)獸藥制劑中金剛烷胺添加量進(jìn)行檢測(cè)，建立了獸藥制劑中違禁藥物金剛烷胺的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法。用5 %氨水甲醇∶異丙醇（4∶1）超聲提取試樣中違禁添加物金剛烷胺，以0.1 %甲酸/甲醇溶液進(jìn)行梯度洗脫，采用電離噴霧電離方式（ESI+），通過(guò)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）定量。該法靈敏度高，線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r達(dá)到0.99，回收率在80.2%～99.8%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均小于8%。方法快速、簡(jiǎn)便、精確度高、準(zhǔn)確度高，適用于獸藥制劑中金剛烷胺違法添加的定性、定量分析。

關(guān)鍵詞：獸藥制劑；金剛烷胺；違禁藥物；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

中圖分類號(hào)：O657.7+2；S959.79 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）01-0180-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.01.047

金剛烷胺又叫鹽酸金剛烷胺，為對(duì)稱的三環(huán)癸烷，于1960年首次合成，是國(guó)際醫(yī)學(xué)界公認(rèn)對(duì)流感病毒有抑制作用的抗病毒藥物[1]，生產(chǎn)上主要用于雞、豬流感的預(yù)防和早期治療，禁止用于抗病毒獸藥、規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)飼料等。但養(yǎng)殖戶存在濫用現(xiàn)象，對(duì)其毒副作用了解不足，用藥劑量偏高，常造成養(yǎng)殖動(dòng)物中毒。

為避免影響國(guó)家動(dòng)物疫病強(qiáng)制性免疫政策落實(shí)，給重大動(dòng)物疫病防控工作帶來(lái)不良后果，農(nóng)業(yè)部于2005年以農(nóng)醫(yī)發(fā)[2005]33號(hào)文發(fā)布了《關(guān)于清查金剛烷胺等抗病毒藥物的緊急通知》，規(guī)定除經(jīng)批準(zhǔn)生產(chǎn)、使用的疫苗產(chǎn)品外，禁止將金剛烷胺用于防治高致病性禽流感等一類病原微生物引起的病毒性疫病[2]。

目前國(guó)內(nèi)尚未確定獸藥制劑中金剛烷胺殘留量測(cè)定的法定方法，文獻(xiàn)報(bào)道有動(dòng)物源食品[3-9]、藥物[10-12]和人體血漿[13]中檢測(cè)，鮮見(jiàn)獸藥制劑中金剛烷胺殘留量測(cè)定方法的報(bào)道。本研究根據(jù)金剛烷胺的化學(xué)性質(zhì)，以現(xiàn)有的文獻(xiàn)為基礎(chǔ)，采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)獸藥制劑中金剛烷胺添加量進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)分析，該方法檢測(cè)靈敏度高、專屬性強(qiáng)，對(duì)保障獸藥安全具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

ACQUITY Ultra Performance LC超高效液相色譜儀（美國(guó)，Waters公司），TQD串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀（美國(guó)，Waters公司），離心機(jī) HC-3518，渦旋混合器TALBOYS Advanced Vortex Mixer，KQ-500DB型超聲波發(fā)生器。

異丙醇和氨水（中國(guó)，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司），甲醇（美國(guó)，F(xiàn)isher公司），金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)品（德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司），試驗(yàn)用水均為蒸餾水。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理 準(zhǔn)確稱取1.00 g試樣至50 mL離心管中，加入10.00 mL 5% 氨水甲醇∶異丙醇（4∶1）溶液超聲提取20 min，然后8 000 r/min離心5 min；用移液槍準(zhǔn)確移取1.0 mL上清液至10 mL試管中，上清液用氮?dú)獯抵两?，?zhǔn)確吸取1 mL 1∶9的0.1%甲酸水溶液∶甲醇溶液到該試管中，渦旋復(fù)溶，過(guò)0.22 μm濾膜至進(jìn)樣瓶，進(jìn)行儀器分析。

1.2.2 色譜條件 色譜柱C18柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；柱溫35 ℃；流速0.3 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；流動(dòng)相0.1%甲酸和甲醇，梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

1.2.3 質(zhì)譜條件 電離方式電噴霧電離（ESI+）；掃描方式正離子掃描；離子源溫度110 ℃；脫溶劑氣溫度380 ℃；錐孔氣流氮?dú)?，流?0 L/h；去溶劑氣流氮?dú)猓魉?00 L/h；碰撞氣氬氣，碰撞氣壓3.50×10-4 MPa；檢測(cè)方式多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)條件見(jiàn)表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法的線性范圍

用基質(zhì)空白將金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋至適當(dāng)濃度（0.00、0.05、0.10、0.20、0.50 mg/L）進(jìn)行測(cè)定，以峰面積（Y）為因變量，相應(yīng)的濃度（X）為自變量作圖。結(jié)果表明，金剛烷胺溶液濃度與對(duì)應(yīng)的峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.996 2。以信噪比（S/N）≥10計(jì)算，方法的定量限為0.5 mg/kg。

2.2 方法的回收率與精密度

按照SN/T0001標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定，禁用物質(zhì)或未設(shè)定容許限的物質(zhì)，一般選擇LOQ、2LOQ、10LOQ作為添加濃度水平進(jìn)行回收率試驗(yàn)，本方法用不含以上金剛烷胺的空白樣品基質(zhì)進(jìn)行3個(gè)濃度水平（0.5、1.0、5.0 mg/kg）的添加回收試驗(yàn)，每個(gè)濃度水平進(jìn)行6次重復(fù)試驗(yàn)，測(cè)得各種農(nóng)藥的回收率范圍在80.2%～99.8%之間，RSD均小于8%。

2.3 提取溶液的優(yōu)化

金剛烷胺略溶于水，溶于乙醇、氯仿，不溶于苯和乙醚。研究者在測(cè)定復(fù)方氨酚烷胺膠囊中鹽酸金剛烷胺及對(duì)乙酰氨基酚的含量時(shí)采用水提取膠囊中的金剛烷胺[14]，也有人選擇流動(dòng)相乙腈∶水（7∶3，m/v，g/mL，下同）來(lái)提取片劑中的金剛烷胺[15]；結(jié)合文獻(xiàn)的提取方法與儀器公司給予的技術(shù)參考，并考慮氯仿的毒性較大且與反相液相色譜的兼容性，分別考察了水、乙腈、乙醇、異丙醇、5%氨水甲醇∶異丙醇（4∶1）的提取效果，提取效果見(jiàn)圖1，最后選擇5%氨水甲醇∶異丙醇（4∶1）作為提取溶劑。

2.4 儀器條件的優(yōu)化

采用自動(dòng)進(jìn)樣，在正離子模式下進(jìn)行條件優(yōu)化；選擇金剛烷胺最佳的分子離子峰以及其錐孔電壓，對(duì)碎片選擇及碰撞能量進(jìn)行優(yōu)化；在優(yōu)化條件下，金剛烷胺的標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜見(jiàn)圖2。

2.5 獸藥制劑中金剛烷胺非法添加情況

按照建立的方法對(duì)市面上收集的15批獸藥制劑喹氟寧、替米考星溶液、氟苯尼考粉、水溶性氟苯尼考（氟苯尼考粉）、心肝包治（恩諾沙星可溶性粉）、硫酸新霉素（硫酸新霉素可溶性粉）等進(jìn)行金剛烷胺添加的普查，15份獸藥制劑均未檢出金剛烷胺添加。

3 結(jié)論

根據(jù)金剛烷胺的化學(xué)性質(zhì)，結(jié)合已有提取方法與儀器公司給予的技術(shù)參考，采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)獸藥制劑中金剛烷胺添加量進(jìn)行檢測(cè)，建立了高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜-電噴霧正離子測(cè)定獸藥制劑中非法添加物金剛烷胺的檢測(cè)方法。該法快速、簡(jiǎn)單、有效、回收率高，可很大程度上降低日常檢測(cè)過(guò)程中的檢測(cè)成本，縮短檢測(cè)周期，為獸藥制劑中非法添加金剛烷胺檢測(cè)提供了有效的前處理方法和檢測(cè)手段。

參考文獻(xiàn)：

[1] 趙德華，賀 凱，馬 玲，等.HPLC-ELSD法測(cè)定鹽酸金剛烷胺片的含量[J].寧夏醫(yī)學(xué)雜志，2011，33（11）：1045-1046.

[2] 陸桂萍，曲 斌，耿士偉，等.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)雞肉中金剛烷胺殘留的研究[J].中國(guó)家禽，2013，35（13）：32-34.

[3] BJORN J. A，BERENDSEN ROBIN S，WEGH MARTIEN L， et al. Quantitative trace analysis of a broad range of antiviral drugs in poultry muscle using column-switch liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry[J]. Anal Bioanal Chem，2012，402：1611-1623.

[4] 艾連峰，馬育松，陳瑞春，等.在線凈化液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定動(dòng)物源食品中金剛烷胺的殘留[J].分析化學(xué)，2013，41（8）：1194-1198.

[5] 孫海新，曹立民，林 洪，等.HPLC-MS/MS法檢測(cè)雞肉食品中金剛烷胺殘留[J].食品工業(yè)科技，2013，34（12）：61-64，89.

[6] 云 環(huán)，崔鳳云，嚴(yán) 華，等.超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定雞肉中的利巴韋林和金剛烷胺[J].色譜，2013，31（8）：724-728.

[7] 邵琳智，姚仰勛，謝敏玲，等.親水相互作用色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定動(dòng)物組織中金剛烷胺與利巴韋林[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2013，32（12）：1448-1452.

[8] 陳慧華，韋敏玨，周 煒，等.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定動(dòng)物組織中金剛烷胺和金剛乙胺的殘留量[J].質(zhì)譜學(xué)報(bào)，2013，34（4）：226-232.

[9] 云 環(huán)，張朝暉，羅生亮，等.固相萃取/LC-MS/MS法檢測(cè)動(dòng)物源性食品中的金剛烷胺[J].現(xiàn)代儀器，2009，15（6）：42-45.

[10] 聶朝霞，李健和，彭詞艷，等.高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法同時(shí)測(cè)定鹽酸金剛烷胺和馬來(lái)酸氯苯那敏的血藥濃度[J].中國(guó)藥業(yè)，2012，21（8）：20-23.

[11] 尚博揚(yáng)，彭福林，馬 玲，等.鹽酸金剛烷胺顆粒鑒別與含量測(cè)定方法的改進(jìn)[J].寧夏醫(yī)學(xué)雜志，2011，33（4）：328-330.

[12] 徐曉峰，陳 珺，宋 敏，等.LC-MS/MS法研究氨金黃敏顆粒中對(duì)乙酰氨基酚、鹽酸金剛烷胺和馬來(lái)酸氯苯那敏的人體藥動(dòng)學(xué)及相對(duì)生物利用度[J].中國(guó)新藥雜志，2008，17（5）：412-417.

[13] HANS J. LEIS W W. Determination of memantine in human plasma by GC using negative ion chemical ionization MS detection after derivatization with a new reagent[J]. Microchim Acta，2012，178：309-314.

[14] 修 虹，黃榕珍，付梅春，等.HPLC-ELSD法測(cè)定復(fù)方氨酚烷胺膠囊中鹽酸金剛烷胺及對(duì)乙酰氨基酚的含量[J].中國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn)，2006，7（1）：23-25.

[15] 裴 璐，張愛(ài)兵.高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器法測(cè)定鹽酸金剛烷胺片中鹽酸金剛烷胺含量[J].中國(guó)藥業(yè)，2012，21（24）：59-60.