β—甘露聚糖酶異源表達及甘露寡糖制備研究

摘要：以產(chǎn)β-甘露聚糖酶（MAN）的枯草芽孢桿菌HD145為目的菌株，PCR擴增MAN基因片段，克隆到pHBM905A載體并轉(zhuǎn)化至畢赤酵母，重組子利用甲醇進行誘導(dǎo)。純化的MAN酶解槐豆膠與瓜爾豆膠，質(zhì)譜檢測水解產(chǎn)物。SDS-PAGE結(jié)果表明，MAN基因?qū)崿F(xiàn)了表達，搖瓶酶活性為3 200 U/mL，酶最適溫度與pH分別為55 ℃與6.0，pH 4～7時穩(wěn)定性較好，在40、50、60 ℃的半衰期分別為165、105、42 min，Zn2+、Ag+、Co2+對酶活性存在一定的抑制。槐豆膠與瓜爾膠經(jīng)MAN酶解后得到二糖至十糖的寡糖。

關(guān)鍵詞：甘露聚糖酶；克?。槐磉_；甘露寡糖

中圖分類號：Q939 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）01-0176-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.01.046

甘露聚糖酶是一種內(nèi)切水解酶，特異性降解β-1，4糖苷鍵，底物包括甘露聚糖、葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖及葡萄半乳甘露聚糖等，而這些底物是組成植物半纖維素的第二大組分，所以甘露聚糖酶在飼料、畜牧生產(chǎn)、食品保健、造紙及紡織等領(lǐng)域具有很好的應(yīng)用前景[1，2]。目前，國內(nèi)外對甘露聚糖酶的研究主要集中在從環(huán)境中篩選產(chǎn)酶菌株[3，4]，對菌種進行誘導(dǎo)育種[5]，優(yōu)化發(fā)酵產(chǎn)酶工藝[6，7]，將酶基因克隆在芽孢桿菌[8]、大腸桿菌[9，10]及畢赤酵母[11]中異源表達等方面。甘露寡糖是甘露聚糖酶水解以上底物產(chǎn)生的產(chǎn)物，在醫(yī)藥、功能性食品、保健領(lǐng)域表現(xiàn)出獨特的活性，已成為研究熱點[12]。能被甘露聚糖酶降解的底物來源主要有魔芋（葡甘聚糖）、田菁膠（半乳甘露聚糖）、槐豆膠（半乳甘露聚糖）及瓜爾膠（半乳甘露聚糖）。目前，國內(nèi)研究的對象主要是魔芋[13，14]，而對于槐豆膠與瓜爾膠的酶解研究相對較少。

本試驗對枯草芽孢桿菌甘露聚糖酶基因進行克隆并在畢赤酵母中實現(xiàn)可溶性表達，提高酶活性，再以槐豆膠與瓜爾膠為對象進行酶解，分析產(chǎn)物組分，為工業(yè)化生產(chǎn)甘露寡糖及寡糖的功能開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 枯草芽孢桿菌HD145與大腸桿菌XL10-Gold由湖北大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)實驗室保存。畢赤酵母GS115菌株購于美國Invitrogen公司，在pPIC9K上進行改造得到質(zhì)粒pHBM905A?；倍鼓z與瓜爾膠購于美國Sigma公司。

1.1.2 試劑和儀器 限制性內(nèi)切酶購于寶生物工程（大連）有限公司，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)購于上海碧云天生物公司，其他試劑購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司。基質(zhì)輔助激光解吸飛行時間質(zhì)譜儀，購于美國布魯克道爾頓公司。

1.2 方法

1.2.1 表達載體pHBM905A-man的構(gòu)建 設(shè)計引物pBS-F（GTCACATACTGTGTCGCCTGTGAATCC，下劃線部分含CpoⅠ黏性末端）與pBS-R（GGCCATCACTCAACGATTGGCGTTAAAG，下劃線部分含NotⅠ黏性末端），以枯草芽孢桿菌HD145總DNA為模板，進行PCR擴增（94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s ，72 ℃延伸35 s；25個循環(huán)）。擴增產(chǎn)物在含dTTP的體系中經(jīng)T4 DNA聚合酶消化15～20 min，形成CpoⅠ與NotⅠ黏性末端，再與P.pastoris表達載體pHBM905A連接（pHBM905A預(yù)先經(jīng)CpoⅠ與NotⅠ消化），重組載體記為pHBM905A-man，詳細構(gòu)建過程參考文獻[15]。pHBM905A-man轉(zhuǎn)化E. coli XL10-Gold，經(jīng)菌落PCR篩選陽性轉(zhuǎn)化子，并進行測序。

1.2.2 酵母轉(zhuǎn)化 重組載體pHBM905A-man經(jīng)SalⅠ線性化處理，電轉(zhuǎn)P. pastoris GS115（7 500 V/cm， 25 lF， 400 X，Bio-Rad Gene Pulser， USA）。陽性重組子在MD培養(yǎng)基上經(jīng)菌落PCR驗證。

1.2.3 甘露聚糖酶重組表達 挑取活性高的酵母重組子，在100 mL BMGY中 28 ℃ 培養(yǎng) 2 d，4 ℃ 5 000 r/min離心10 min收集菌體，轉(zhuǎn)入BMMY中25 ℃甲醇誘導(dǎo)，過程參考Pichia Expression Kit操作手冊。

1.2.4 酶活性測定 甘露聚糖酶測定參考文獻[16]。

1.2.5 重組酶純化 誘導(dǎo)液在4 ℃、12 000 r/min離心15 min，收集上清液，于75%硫酸銨4 ℃過夜，12 000 r/min離心15 min，收集沉淀，溶解于50 mmol/L pH 6.0醋酸鈉緩沖液中，轉(zhuǎn)入45 cm Sephadex G-100柱（Pharmacia），收集液體，用于性質(zhì)分析。

1.2.6 酶性質(zhì)分析 在pH 2.0～10.0范圍內(nèi)，分別用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（pH 2.0～6.0）、磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液（pH 6.0～8.0）及甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液（pH 8.0～10.0）測定酶的最適反應(yīng)pH；在30～90 ℃范圍內(nèi)，測定酶的最適反應(yīng)溫度。

酶pH穩(wěn)定性測定：先將酶在不同的pH緩沖液中保留一定時間，再調(diào)回到最適pH，測定酶殘留活性。分別在40、50、60 ℃條件下保留不同的時間，測定酶熱穩(wěn)定性。

金屬離子對酶活性的影響：將酶在10 mmol/L不同金屬離子體系（100 mmol/L醋酸鈉，pH 5.5，室溫） 中保留1 h，測定酶活性。

1.2.7 甘露寡糖酶解制備 分別于pH 5.0、6.0、7.0、8.0條件下，配制2%的槐豆膠及瓜爾膠底物，按底物∶酶=1∶20（質(zhì)量比）添加酶液，于50 ℃反應(yīng)過夜，檢測酶解產(chǎn)物。

1.2.8 酶解產(chǎn)物分析 甘露寡糖酶解產(chǎn)物的檢測應(yīng)用質(zhì)譜儀（Ultraflex Ⅱ MALDI-TOF/TOF，反射模式）進行分析。酶解液于12 000 r/min 4 ℃離心15 min，吸取15 μL上清液與等體積的55%乙醇混勻，從混合液中吸取5 μL再與等體積的2，5-二羥基苯甲酸基質(zhì)混勻，利用質(zhì)譜儀對混勻液進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因擴增

以芽孢桿菌總DNA為模板，利用引物進行擴增，得到與預(yù)計大小相符，約1 011 bp的目的MAN基因片段（圖1）。

2.2 重組蛋白在畢赤酵母中的表達

挑選陽性酵母重組子（pHBM905A-man）進行搖瓶表達，以不含目的基因的轉(zhuǎn)化子（pHBM905A）為負對照，甲醇誘導(dǎo)120 h后，離心收集上清液，進行SDS-PAGE電泳檢測，經(jīng)考馬斯亮藍R250染色，觀察電泳結(jié)果。如圖2所示，在陽性重組子泳道約41 ku大小處有一明顯條帶，分子質(zhì)量與預(yù)期相符，且純度較高，而在陰性對照泳道，不含任何條帶，說明目的基因?qū)崿F(xiàn)了表達，搖瓶甘露寡糖酶活性為3 200 U/mL。

2.3 酶學(xué)特性

純化后的重組酶最適pH與溫度分別為6.0與55 ℃，在pH 4～7穩(wěn)定性較好；在40、50、60 ℃的半衰期分別為165、105、42 min，如圖3所示。在10 mmol/L的金屬離子下，Zn2+、Co2+和Ag+對重組酶活性存在一定的抑制作用，如表1所示。

2.4 酶解產(chǎn)物分析

試驗結(jié)果表明，槐豆膠與瓜爾膠在pH 6條件下能較好地水解，其酶解產(chǎn)物經(jīng)離心后，上清液于質(zhì)譜條件下分析，根據(jù)質(zhì)核比（m/z）推測產(chǎn)物組分，結(jié)果如圖4所示。兩者都能被重組酶水解生成寡糖，槐豆膠的酶解產(chǎn)物組分主要是5～11糖及少量的2～4糖，瓜爾膠的酶解產(chǎn)物是2～11糖。

3 討論

目前甘露聚糖酶的應(yīng)用主要是通過底物誘導(dǎo)微生物產(chǎn)生，但酶活性、產(chǎn)量及純度不高，不適于工業(yè)化應(yīng)用，所以酶基因的克隆表達成為研究熱點，而由于畢赤酵母表達系統(tǒng)的優(yōu)點，成為表達宿主的首選，已有芽孢桿菌[11，17，18]、曲霉[14，16，19，20]、青霉[21]等不同微生物的MAN基因在畢赤酵母中實現(xiàn)了表達。本試驗將篩選獲得的枯草芽孢桿菌MAN基因克隆在畢赤酵母中，實現(xiàn)了高活性表達，與上述重組酶在酶活性、催化溫度、pH、穩(wěn)定性及金屬離子影響性等方面表現(xiàn)出獨特的性質(zhì)，為工業(yè)化酶的應(yīng)用提供了新的資源與選擇。

關(guān)于MAN酶解槐豆膠與瓜兒膠制備甘露寡糖的研究相對較少，目前只有少量在瓜兒膠水解方面的報道[22，23]。本試驗對兩種底物進行酶解，為甘露聚糖酶的功能開發(fā)提供新的思路，后期對酶解工藝及控制進行優(yōu)化，制備不同分子質(zhì)量范圍的寡糖，可提高寡糖的應(yīng)用價值。

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