山慈菇提取液對(duì)小鼠4T1乳腺癌細(xì)胞抑制作用機(jī)制的研究

摘要：探索山慈菇提取液對(duì)小鼠4T1細(xì)胞抑制作用機(jī)制。采用水煎法制備山慈菇提取液，MTT比色法檢測(cè)小鼠4T1細(xì)胞的增殖活性，AnnexinV/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測(cè)細(xì)胞凋亡。結(jié)果表明，山慈菇提取液對(duì)4T1細(xì)胞有明顯的增殖抑制作用（P<0.05）， 并呈劑量依賴關(guān)系。山慈菇提取液誘導(dǎo)小鼠4T1細(xì)胞凋亡效果明顯，并有劑量依賴性。山慈菇提取液對(duì)小鼠乳腺癌細(xì)胞有明顯的增殖抑制和誘導(dǎo)其細(xì)胞凋亡的作用。

關(guān)鍵詞：山慈菇；4T1細(xì)胞；增殖抑制；細(xì)胞凋亡

中圖分類號(hào)：R273 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）01-0134-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.01.035

山慈菇為蘭科植物杜鵑蘭Cremastra appendiculata（D.Don） Makino、獨(dú)蒜蘭Pleione bulbocodioides（Franch.）Rolfe或云南獨(dú)蒜蘭PLeione yunnanensis Rolfe的干燥假鱗莖。具有清熱解毒、化痰散結(jié)之功效[1]。是貴州著名的藥材之一，已被列入國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)的藥用植物，具有很大的開發(fā)價(jià)值。在近年的研究中，以山慈菇為主要成分所展開抗腫瘤的研究也相對(duì)增多，林如輝等[2]、曾迪等[3]、吳俊林等[4]、夏文斌等[5]分別用山慈菇提取物誘導(dǎo)胃癌SGC-7901凋亡、侵襲肝癌SMMC7-721黏附能力、中藥山慈菇對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞的促凋亡作用及腫瘤細(xì)胞毒活性篩選等試驗(yàn)說明山慈菇具有抗腫瘤活性。文獻(xiàn)表明[6-12]，在現(xiàn)代臨床應(yīng)用中山慈菇多以配伍的復(fù)方藥物及中藥處方治療乳腺增生、乳腺癌以及結(jié)合放化療，應(yīng)用于肺癌、胃癌、大腸癌等多種惡性腫瘤的作用，具有明顯的治療效果，同時(shí)也減輕其臨床癥狀、癌疼痛等，延長(zhǎng)生存期和提高生存質(zhì)量。

本試驗(yàn)通過研究山慈菇提取液對(duì)小鼠乳腺癌細(xì)胞4T1的增殖活性影響，探討山慈菇的抗腫瘤的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

4T1細(xì)胞購(gòu)買于上海吉泰生物技術(shù)有限公司，山慈菇購(gòu)于貴州省遵義市，MTT（博士德生物工程有限公司），細(xì)胞凋亡試劑盒（南京凱基），自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Multiskan GO）、流式細(xì)胞儀（德國(guó)PARTEC Cyflow Cube）

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 山慈菇提取液的制備 將山慈菇4 ℃浸泡過夜后，搗成細(xì)塊后，水煎法1 h制備水提液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至藥液濃度為生藥1.5 g/mL，過濾除菌，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 4T1細(xì)胞培養(yǎng)于含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)，2～3 d換液傳代。取進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，胰酶消化，PBS洗滌，用DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104/mL的單細(xì)胞懸液備用。

1.2.3 細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)（MTT法） 將提取的山慈菇提取液分別按1.50、1.25、1.0、0.75、0.50 g/mL稀釋為5個(gè)濃度。對(duì)照組為等量PBS處理，空白組為不含細(xì)胞的培養(yǎng)液，每組設(shè)5個(gè)重復(fù)。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板，每孔200 μL，標(biāo)準(zhǔn)條件下分別培養(yǎng)24 h后，加入對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組對(duì)應(yīng)藥液各20 μL。分別培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL繼續(xù)培養(yǎng)4 h，培養(yǎng)結(jié)束后，棄上清，每孔加入DMSO 150 μL ，震蕩10 min，于自動(dòng)酶標(biāo)檢測(cè)儀上490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔OD值。

1.2.4 Annexin V/PI雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡 4T1細(xì)胞經(jīng)1.5、1.25、1.0、0.75、0.50 g/mL濃度的山慈菇液作用24 h后，分別收集細(xì)胞1×106，冷PBS洗滌兩次，加入500 μL結(jié)合緩沖液，吹打均勻，加入Annexin V、PI各5 μL，混勻，避光染色15 min，上機(jī)檢測(cè)。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS16.0軟件包進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 MTT細(xì)胞增殖

由表1可知，山慈菇提取物對(duì)小鼠4T1細(xì)胞增殖有明顯抑制作用，不同濃度間的抑制作用有一定的差異。

2.2 Annexin V/PI雙染，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞

由圖1可知，山慈菇提取液對(duì)小鼠4T1乳腺癌細(xì)胞有不同程度的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。由圖2可知，早期凋亡圖示中顯示1.50、1.25、1.00 g/mL與對(duì)照組差異顯著（P<0.05）。在晚期凋亡中1.50、1.25 g/mL組與對(duì)照組差異顯著（P<0.05），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖3為凋亡細(xì)胞經(jīng)Annexin V/PI雙染后的結(jié)果。

3 討論

山慈菇提取物作用4T1細(xì)胞出現(xiàn)明顯的細(xì)胞增殖抑制作用，細(xì)胞形態(tài)呈不同程度變化，細(xì)胞體積縮小，部分細(xì)胞連接消失，核質(zhì)皺縮，胞內(nèi)核內(nèi)有微小顆粒，部分細(xì)胞出現(xiàn)死亡，高濃度的山慈菇提取液組尤為明顯，死亡細(xì)胞數(shù)量較多，說明山慈菇還具有一定的細(xì)胞毒性，應(yīng)控制山慈菇的用量。Annexin V/PI雙染流式結(jié)果顯示山慈菇有明顯誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，這一機(jī)制可能是山慈菇抗腫瘤活性的主要靶點(diǎn)。目前中藥化學(xué)成分的研究基礎(chǔ)較為薄弱，藥效基礎(chǔ)物質(zhì)不是非常的明確。中草藥抗癌有效成分歸納為生物堿、萜類化合物、多糖類、酸類化合物、其他化合物等成分[13]。秋水仙堿是百合科植物的一種重要的生物堿，對(duì)細(xì)胞有絲分裂有明顯的抑制作用，在臨床中主要作為抗癌藥物使用，此外，對(duì)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎有特異的治療作用。我國(guó)主要從麗江山慈菇鱗莖中獲得秋水仙堿[14]。本試驗(yàn)從山慈菇中提取含秋水仙堿的有效活性成分同樣具有抗腫瘤活性，而中藥抗腫瘤的多靶點(diǎn)效應(yīng)也是抗腫瘤研究的其中一個(gè)機(jī)制，主要通過抗腫瘤血管生成、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制端粒酶活性等機(jī)制抑制腫瘤[15]。試驗(yàn)結(jié)果表明，山慈菇對(duì)小鼠4T1乳腺癌細(xì)胞有明顯的增殖抑制作用，并且在一定的濃度作用下有明顯誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。為進(jìn)一步探討和研究山慈菇應(yīng)用于臨床治療乳腺癌及其他癌癥的可行性提供一定的基礎(chǔ)。山慈菇生物活性較高，來源廣泛，現(xiàn)代臨床多作為抗癌中藥配伍使用，有望成為治療乳腺癌已及其他癌癥的有效藥物。

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