沙棘維生素C積累與相關(guān)酶活性關(guān)系研究

摘要：探討沙棘（Hippophae rhamnoides Linn.）不同器官中抗壞血酸（AsA）積累與相關(guān)代謝酶活性的關(guān)系。結(jié)果表明，AsA在沙棘幼葉和果實中含量較高，在莖和花中含量較低。沙棘幼葉和果實中AsA含量主要受L-半乳糖-1，4-內(nèi)酯脫氫酶（GalLDH）和脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）活性調(diào)節(jié)，抗壞血酸氧化酶（AAO）和抗壞血酸過氧化物酶（APX）對AsA的積累也有調(diào)節(jié)作用。

關(guān)鍵詞：沙棘（Hippophae rhamnoides Linn.）；抗壞血酸（AsA）；L-半乳糖-1， 4-內(nèi)酯脫氫酶（GalLDH）；抗壞血酸氧化酶（AAO）；抗壞血酸過氧化物酶（APX）；單脫氫抗壞血酸還原酶（MDHAR）；脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）

中圖分類號：S793.6 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）01-0120-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.01.032

沙棘（Hippophae rhamnoides Linn.）屬胡頹子科沙棘屬植物，沙棘果實是中國古代藏醫(yī)、蒙醫(yī)的常用藥物。中國是沙棘屬植物分布面積最大、種類最多的國家[1，2]。沙棘果實中維生素C含量高，素有“維生素C之王”的美稱。維生素C又名抗壞血酸（Ascorbic acid，AsA），可以作為輔酶在植物光合作用、細胞分裂和生長代謝中發(fā)揮重要作用[3-5]，同時AsA也是植物和大多數(shù)動物體內(nèi)一種重要的抗氧化劑，人類由于缺乏其合成關(guān)鍵酶而不能合成AsA，只能從食物中獲取，因此AsA是植物重要的營養(yǎng)指標(biāo)之一[6，7]。

Wheeler等[7]提出植物體內(nèi)合成AsA的途徑中，L-半乳糖-1，4-內(nèi)酯脫氫酶（GalLDH）直接催化半乳糖內(nèi)酯形成AsA，是AsA生物合成途徑的關(guān)鍵酶，GalLDH基因表達水平?jīng)Q定了AsA含量的高低。最近的研究結(jié)果也表明，過量表達GalLDH可以提高煙草BY-2細胞中AsA含量[8]，反義表達GalLDH mRNA導(dǎo)致GalLDH活性顯著下降，以及AsA含量的下降[9]。在植物細胞內(nèi)，抗壞血酸氧化酶（AAO）和抗壞血酸過氧化物酶（APX）是AsA代謝過程中主要的氧化分解酶[10]，這2種酶分別在O2和H2O2的參與下將AsA氧化為不穩(wěn)定的單脫氫抗壞血酸（MDHA），MDHA既可在單脫氫抗壞血酸還原酶（MDHAR）的作用下還原為AsA，也可發(fā)生非酶歧化反應(yīng)形成脫氫抗壞血酸（DHA），DHA可以通過脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）的作用被還原為AsA，因此植物體內(nèi)這4種與AsA代謝相關(guān)的酶活性也將影響AsA水平的高低[3，6，10，11]。目前有關(guān)沙棘維生素C積累的生理機制尚不清楚，為此，本研究通過測定8年生沙棘生長過程中AsA與相關(guān)代謝酶活性的關(guān)系，以期一定程度上揭示沙棘AsA積累的生理機制。

1 材料與方法

1.1 材料

以青海省祁連縣野牛溝鄉(xiāng)達玉村種植的8年生沙棘為研究對象，在沙棘發(fā)芽、長葉、結(jié)果期，采集同一株沙棘上部枝條頂端的葉、莖、果實，去雜質(zhì)后稱重，液氮速凍后置-80 ℃保存?zhèn)溆?。沙棘幼葉、幼莖于6月下旬采集，花于7月中旬采集，幼果于8月中旬采集，成熟果實于9月上旬采集。

1.2 方法

1）AsA含量測定。參考Arakawa等[12]和戚元成等[13]的方法并略作改進。取0.3 g樣本，加入3 mL 5%的TCA研磨成勻漿，4 000 r/min離心10 min，取上清液備用。測定時，5 mL反應(yīng)體系中含有1 mL 5%的TCA、1 mL 50%的EtOH、0.5 mL 0.4%的H3PO4- EtOH、1 mL 5%的BP-EtOH、0.5 mL 0. 03%的FeCl3-EtOH和1 mL樣品提取液。30 ℃水浴反應(yīng)90 min，于波長534 nm處測吸光度。

2）GalLDH活性測定。參考Tabata等[8]、安華明等[11]和徐茂軍等[14]的方法并略作改進。取0.5 g樣本在液氮中研磨成勻漿分裝至試管，加入3 mL 50 mmol/L的磷酸緩沖液（pH 7.8，含0.2 mmol/L Na2EDTA，2%的PVP），然后500 r/min離心10 min，收集上清，10 000 r/min離心20 min后收集沉淀。將沉淀輕懸浮于0.5 mL 50 mmol/L的磷酸緩沖液中，供酶活性測定用。以上操作均在4 ℃下進行。

測定時取2 mL 1.05 mg/mL的細胞色素c（Cytc）、200 μL 56 mmol/L的L-半乳糖內(nèi)酯（L-galactono-1，4-lactone）和200 μL提取液，總體積2.4 mL。測定前先將反應(yīng)混合液于25 ℃預(yù)溫?zé)? min，于波長550 nm處測定吸光度，反應(yīng)從加入L-半乳糖內(nèi)酯后開始計時。以每分鐘吸光度值增加0.01為1個酶活力單位。

3）AAO、APX以及MDHAR、DHAR活性測定。取0.5 g樣品，用液氮勻漿并分裝到離心管，再加入3 mL 50 mmol/L的磷酸緩沖液，12 000 r/min離心20 min，收集上清液備用。

AAO活性測定參考陳利鋒等[15]的方法，取提取液0.12 mL，加入2.88 mL磷酸緩沖液（pH 7.8，0.5 mmol/L）在波長290 nm下測定；APX活性測定參考Nakano等[16]的方法，3 mL的反應(yīng)體系中含有50 mmol/L Hepes-KOH（pH 7.6），1.0 mmol/L H2O2，0.5 mmol/L AsA及0.05 mL樣品提取液，測定波長290 nm處吸光度的變化；MDHAR和DHAR活性測定參考Nakano等[16]、Ma等[17]的方法，測MDHAR活性時3 mL的反應(yīng)體系中含有100 mmol/L Hepes-KOH（pH 7.6），0.1 mmol/L NADH，0.25 mmol/L AsA，0.3 units抗壞血酸氧化酶（AAO）及0.1 mL樣品提取液，在波長340 nm條件下測定吸光度；測定DHAR活性時3 mL的反應(yīng)體系含有50 mmol/L Hepes-KOH（pH 7.6），2.5 mmol/L GSH，0.2 mmol/L DHA及0.1 mL樣品提取液，在波長265 nm條件下測定吸光度。

以上各生理指標(biāo)的測定均重復(fù)3次，含量以鮮重計，試驗數(shù)據(jù)采用SAS軟件Duncan多重比較法（α=0.05）進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙棘不同器官中AsA的含量

從圖1可以看出，沙棘不同器官中AsA含量差異明顯。沙棘幼葉中ASA含量最高，其次是幼果和成熟果實，幼莖和花中含量最低。幼葉中AsA含量分別是幼果、成熟果實、幼莖、花中的1.26、1.35、164.79、149.06倍。結(jié)果表明，沙棘AsA含量在葉時期較高，莖時期較低，進入果實期后呈先上升后下降趨勢。

2.2 沙棘不同器官中GalLDH活性變化

如圖2所示，沙棘幼葉和幼莖中GalLDH活性差異顯著，幼葉中GalLD含量最高，其次是幼果、花、成熟果實，幼莖中GalLDH含量最低。幼葉中GalLDH含量分別是幼莖、花、幼果、成熟果實中的1.49、1.21、1.10、1.33倍。幼葉、花、幼果、成熟果實之間差異不顯著。

2.3 沙棘不同器官中AAO和APX活性變化

沙棘不同器官中AAO與APX活性變化見圖3。從圖3可以看出，幼葉和果實中AAO與APX活性較高，幼莖和花中含量較低。其中成熟果實中AAO活性是幼葉、幼莖、花、幼果中的0.91、2.50、3.95、1.00倍；成熟果實中APX活性是幼葉、幼莖、花、幼果中的1.19、3.22、5.19、1.03倍。二者呈現(xiàn)高度正相關(guān)（表1），相關(guān)系數(shù)為0.98。

2.4 沙棘不同器官中MDHAR與DHAR活性變化

沙棘不同器官中MDHAR活性和DHAR活性的變化見圖4。從圖4可以看出，幼葉中MDHAR活性最高，其中幼葉中MDHAR活性是幼莖、花、幼果、成熟果實中的1.40、2.33、1.30、1.59倍；幼葉DHAR活性是幼莖、花、幼果、成熟果實中的7.56、3.09、4.25、4.25倍?；ㄖ蠱DHAR活性最低，幼莖中DHAR活性最低。

2.5 沙棘果實發(fā)育時期AsA代謝相關(guān)指標(biāo)間的相關(guān)性

Excel程序分析結(jié)果表明（表1），沙棘果實發(fā)育時期AsA與GalLDH、APX呈高度正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.92～0.98；AsA與AAO、MDHAR、DHAR呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.58～0.74。沙棘GalLDH活性與AsA含量變化趨勢基本一致，兩者之間呈極顯著正相關(guān)，表明沙棘AsA的積累主要受GalLDH的調(diào)節(jié)。

3 小結(jié)與討論

GalLDH和DHAR是沙棘維持其體內(nèi)正常的AsA水平及其還原活性的重要酶，沙棘幼葉和果實中AsA的積累主要來自GalLDH催化的生物合成和DHAR催化的DHA還原。此外，抗壞血酸氧化酶（AAO）和抗壞血酸過氧化物酶（APX）是植物體內(nèi)AsA代謝過程中主要的氧化分解酶[9]，它們分別在O2與H2O2的參與下將AsA氧化成不穩(wěn)定的單脫氫抗壞血酸（MDHA），進而形成DHA。本研究中發(fā)現(xiàn)，沙棘AAO與APX活性變化趨勢與AsA的積累過程不同，前期一致，在果實期AsA積累降低而這兩種酶活性升高，表明在整個時期中，沙棘葉、莖積累的AsA被快速氧化，而在進入果實期后，果實中積累的AsA只有極少被氧化。

AsA被AAO與APX氧化為MDHA與DHA，而MDHAR和DHAR可使AsA由氧化態(tài)還原再生為還原態(tài)。Chen等[18]研究發(fā)現(xiàn)DHAR的增強表達可使煙草和大麥葉片中的AsA含量增加2～4倍；但在刺梨果實中卻沒有檢測到MDAR和DHAR的活性[11]。研究結(jié)果表明，在沙棘果實中測得AsA量變少，而AAO、APX活性增高，表明進入果實期后MDHAR與DHAR不斷地還原更多的AsA，但AsA的氧化速度大于還原速度，致使果實期中AsA含量減少，說明這兩種酶是沙棘后期AsA積累的因素，即它們的作用集中體現(xiàn)在生長后期，且DHAR的作用更明顯，但同時也說明這兩種酶不是沙棘各部位積累AsA的關(guān)鍵因素。

沙棘幼葉和果實中GalLDH活性與其AsA水平極顯著正相關(guān)，并與其AsA含量顯著正相關(guān)，表明GalLDH活性是影響沙棘葉片和果實中抗壞血酸水平和含量的一個主要因素，這與以擬南芥、刺梨和蘋果等為試材的研究結(jié)果基本一致[11， 19， 20]。

綜上所述，沙棘中AsA含量主要受GalLDH活性調(diào)節(jié)，同時AsA代謝酶AAO、APX也對AsA積累起到了重要作用，而MDAR、DHAR活性對沙棘中AsA積累的作用主要在生長后期。

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