棗果病原真菌的分離鑒定及特性分析

摘要：對(duì)云南省蒙自市6個(gè)主要棗樹(shù)栽培品種儲(chǔ)藏期的腐爛果實(shí)表面的病原真菌進(jìn)行分離和鑒定，得到25株優(yōu)勢(shì)病原真菌，分別擴(kuò)增得到核糖體DNA轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（Internal transcribed spacer，ITS）序列，通過(guò)對(duì)ITS的生物信息學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育分析，并結(jié)合菌落形態(tài)特征，鑒定病原真菌分別為鏈格孢屬（Alternaria sp.）、曲霉屬（Aspergillus sp.）、葡萄座腔菌屬（Neofusicoccum sp.）和脈紋孢菌屬（Neurospora sp.）。

關(guān)鍵詞： 棗果； 采后病害； 病原真菌； rDNA-ITS； 生物信息學(xué)； 序列分析

中圖分類(lèi)號(hào)：S432.4+4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）01-0070-07

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.01.020

鼠李科（Rhamnaceae）植物棗（Zizyphus jujube Mill）是中國(guó)的原產(chǎn)果樹(shù)之一，已有數(shù)千年的栽培歷史[1]。棗樹(shù)在中國(guó)分布面廣、適應(yīng)性強(qiáng)、品種多、風(fēng)味好，深受廣大群眾的喜愛(ài)，已成為中國(guó)果樹(shù)發(fā)展的新熱點(diǎn)[2]。蒙自小棗是云南蒙自較為古老的地方品種，早在明末清初已有栽培記載[3]。蒙自小棗果實(shí)近圓形，平均單果重7 g。近年來(lái)，蒙自小棗以其外觀亮、皮薄、肉厚且細(xì)膩、味特甜、口感好、品質(zhì)佳、早熟（較國(guó)內(nèi)其他棗種早熟半個(gè)月以上）等優(yōu)勢(shì)熱銷(xiāo)省內(nèi)外[4]，是蒙自三大果林經(jīng)濟(jì)作物（小棗、大枇杷、甜石榴）中單位面積產(chǎn)值最高者。

棗果的自然保鮮能力較差，在貯藏中果實(shí)極易感染微生物而引起腐爛變質(zhì)失去商品價(jià)值，嚴(yán)重制約了中國(guó)紅棗產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。棗果采后病害可分為2種類(lèi)型，一類(lèi)是由于生理活動(dòng)受到不適宜的外界條件干擾而造成的生理病害；另一類(lèi)是由病原微生物引起的病理病害（侵染性病害）。據(jù)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道，病原微生物可侵染棗葉片和棗果，棗葉片上的主要病害有棗瘋病[5，6]、棗銹病[7]和棗葉斑病[8]等；棗果實(shí)主要病害有棗輪紋病[9]、棗縮果病[10]、棗黑腐病[11]、棗炭疽病[12]等。其中棗瘋病、棗銹病和棗縮果病被稱(chēng)為棗樹(shù)的三大病害。在果實(shí)儲(chǔ)藏期，鏈格孢霉（Alternaria tenuis）、莖點(diǎn)霉（Phomaglomerata）等可引起棗果斑點(diǎn)性病害；鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、黑附球菌（Epicoccum nigrum）可引起棗果實(shí)腐爛。因此對(duì)采摘后的棗果致病真菌進(jìn)行分離和鑒定可以為科學(xué)用藥提供有效的指導(dǎo)。

傳統(tǒng)致病菌的鑒定主要通過(guò)形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行，受很多因素的限制。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，18S rDNA基因序列在真菌的分類(lèi)和鑒定系統(tǒng)中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛[13，14]。保守的18S和28S序列有利于屬的鑒定，核糖體DNA轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（Internal transcribed spacer，ITS）則多運(yùn)用于種的鑒定。對(duì)ITS序列進(jìn)行生物信息學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育分析，可以快速闡明菌株之間的進(jìn)化關(guān)系和種群間的親緣關(guān)系[15]。以上方法可以為快速和準(zhǔn)確的鑒定植物真菌病害提供一定基礎(chǔ)。

本研究以云南蒙自地區(qū)的冰糖棗、蒙自小棗、特早金脆蜜棗、胎里紅棗、中華梨棗和早甜蜜甲棗等6個(gè)品種為主要研究對(duì)象，分離和純化引起貯藏期的主要致病真菌，在傳統(tǒng)形態(tài)鑒定的基礎(chǔ)上，對(duì)貯藏期腐爛棗中分離到的菌株進(jìn)行rDNA-ITS序列分析和分子鑒定，為不同品種棗貯藏期真菌病害防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

從云南省蒙自市文瀾鎮(zhèn)白路腳村蒙鑫大棚棗園基地采得冰糖棗、特早金脆蜜棗、胎里紅棗、中華梨棗和早甜蜜甲棗5個(gè)品種的棗果，從云南省蒙自市紅寨鄉(xiāng)高家寨小棗種植園采得蒙自小棗。共采集棗果樣品64份，其中高家寨棗園12份，蒙鑫大棚棗園52份，放入果品專(zhuān)用保鮮袋，4 ℃保存。

1.2 生化試劑

離心柱型基因組DNA提取試劑盒（北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；1×TAE Buffer（0.04 mol/L Tris-Cl，0.001 mol/L EDTA，pH8.0），瓊脂糖（AR），0.5 mg/mL EB，DL5 000 DNA Marker，λ-Hind Ⅲdigest DNA Marker（寶生物工程（大連）有限公司）；2×Taq PCR Master Mix（北京東盛創(chuàng)新生物科技有限公司）。

1.3 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：取馬鈴薯200 g去皮切碎，加入800 mL去離子水，煮沸30 min，冷卻后雙層紗布過(guò)濾，取濾液，加葡萄糖20 g，定容至1 L，高壓蒸汽115 ℃滅菌20 min，備用。

PDA固體培養(yǎng)基：在PDA培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，加入1.5%～2%的瓊脂粉。

1.4 病原菌分離純化與菌株命名

組織分離法：用滅菌刀片分離病健處約5 mm2的果實(shí)組織塊，浸泡于體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇中30 s，然后用NaClO溶液處理1～3 min，去離子水沖洗3次，移入PDA平板上倒置于霉菌培養(yǎng)箱中，28 ℃培養(yǎng)3 d后觀察菌落生長(zhǎng)狀況。

劃線(xiàn)分離法：將分離獲得的真菌菌落培養(yǎng)產(chǎn)生孢子，用接種針挑取不同形態(tài)的病原真菌的孢子或菌絲，在PDA平板上劃線(xiàn)，培養(yǎng)條件同上。重復(fù)劃線(xiàn)分離3～4次后即可純化不同的單菌落菌株。不易純化的菌株采取稀釋平板法獲得單孢純化。

純化所得菌種分別照樣品品種名稱(chēng)前兩個(gè)漢字的拼音首字母大寫(xiě)組合及菌株分離順序依次編號(hào)命名，如冰糖棗中分離到的第4株菌命名為BT4。4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 單菌落培養(yǎng)與形態(tài)觀察

點(diǎn)植法：菌落疏松易于挑取菌絲的菌株，用接種針挑起菌落邊緣的少許菌絲，點(diǎn)植于平板PDA中央，進(jìn)行平板封口后倒置于霉菌培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)5～7 d，即可得到均勻單一的菌落。

移植法：菌落致密緊貼平板的菌株直接用打孔器從已純化菌落上取適宜大小的菌餅接種；孢子較多的菌株用去離子水稀釋的孢子懸浮液接種，置于霉菌培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)5～7 d，即可得到均勻單一菌落。

形態(tài)學(xué)觀察：培養(yǎng)5～7 d后，先觀察單菌落的形態(tài)特征，后進(jìn)行菌落插片培養(yǎng)，以去離子水為負(fù)載劑制片后，熒光顯微鏡下觀察各菌株細(xì)胞形態(tài)特征。

1.6 基因組DNA的提取

28 ℃條件下，搖瓶培養(yǎng)各菌株收集菌絲體，去離子水沖洗培養(yǎng)基及雜質(zhì)，濾紙吸干水分，液氮充分研磨菌絲體至粉末，裝入1.5 mL離心管中，用真菌DNA提取試劑盒提取基因組DNA[16]，具體步驟參照試劑盒使用說(shuō)明書(shū)，后用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所提取基因組DNA的完整性。

1.7 基于真菌rDNA-ITS序列的分子鑒定

rDNA-ITS序列的擴(kuò)增參照White等[17]的方法。以基因組DNA為模板，運(yùn)用通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）（南京金斯瑞生物科技有限公司）擴(kuò)增致病真菌的ITS基因。

PCR擴(kuò)增體系：模板DNA（0.5 μg/μL）3.0 μL，2×PCRmix（廣東東勝生物科技有限公司）12.5 μL，ITS1、ITS4引物（10.0 μmol/L）各2.0 μL，加ddH2O至25.0 μL。

PCR擴(kuò)增程序：94 ℃，預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。

1.8 序列比對(duì)及分子系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

檢測(cè)純化回收PCR產(chǎn)物并由南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序，采用ClustalW 2.0軟件比對(duì)ITS基因序列，設(shè)置空位罰分為10、BLOSUM權(quán)重矩陣[18]。將各菌株ITS序列結(jié)果登陸到GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)BLAST程序搜索數(shù)據(jù)庫(kù)中相關(guān)高度相似序列。通過(guò)CLUSTAL_X和Mega 4.1軟件采用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹(shù)，并計(jì)算Bootstrap值，分析菌株之間在進(jìn)化上的親緣關(guān)系[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離純化

分別用PDA培養(yǎng)基分離純化獲得16個(gè)株菌，接種于PDA平板中央置于霉菌培養(yǎng)箱中28 ℃進(jìn)行培養(yǎng)；其中，菌絲生長(zhǎng)較快的菌株培養(yǎng)3 d，菌絲生長(zhǎng)速度中等的菌株培養(yǎng)5～7 d，而產(chǎn)孢子且生長(zhǎng)慢的菌株培養(yǎng)9 d，多數(shù)菌落的顏色、大小、形狀、菌絲或孢子等差異較為明顯，其中BT（冰糖棗）、ZH（中華梨棗）、ZT（早甜蜜甲棗）這3個(gè)品種的棗果上分離出來(lái)的4號(hào)、38號(hào)、41號(hào)、43號(hào)以及49號(hào)病原真菌培養(yǎng)于PDA平板上28 ℃可以產(chǎn)生孢子。各樣品分離純化的菌株的編號(hào)、培養(yǎng)周期及其產(chǎn)孢結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2 菌株的形態(tài)學(xué)觀察

所分離的16個(gè)菌株在28 ℃條件下PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行單菌落培養(yǎng)，根據(jù)其生長(zhǎng)速度快慢分別培養(yǎng)3、5～7 d和9 d后觀察菌落形態(tài)；其間，于單菌落長(zhǎng)出后在其邊緣進(jìn)行插片，菌絲爬片或產(chǎn)孢后進(jìn)行鏡檢。菌落形態(tài)觀察包括菌落正反面顏色、菌落邊緣形狀、菌落表面布紋、菌落高度、菌落大小、菌落質(zhì)地以及菌絲長(zhǎng)短、粗細(xì)、有無(wú)橫膈及核、分枝、分生孢子梗、分生孢子形態(tài)和產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)等[20，21]（圖1）。所分離菌株的單菌落形態(tài)、菌絲和孢子的顯微特征（圖2），各菌株的菌落形態(tài)、菌絲和孢子的顯微特征描述見(jiàn)表2。

2.3 致病菌株基因組DNA和ITS基因序列分析

本試驗(yàn)獲得的致病霉菌基因組DNA片段經(jīng)DNA電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示，多數(shù)菌株基因組DNA分子量大約為10～20 kb（圖3A），多數(shù)菌株ITS基因大小在500～750 bp之間（圖3B），而菌株TJ29、TL35、TL36和ZT46的ITS基因大小在250～500 bp之間，菌株ZH38、ZT45和ZT49的ITS基因大小在750～ 1 000 bp之間。測(cè)序結(jié)果顯示各菌株ITS基因長(zhǎng)度為316～928 bp，約56%的菌株ITS序列長(zhǎng)度在500～750 bp之間，25%的菌株ITS序列長(zhǎng)度在250～500 bp之間，約19%的菌株ITS序列長(zhǎng)度在750～1 000 bp之間，與電泳檢測(cè)結(jié)果基本一致，所有菌株的ITS序列平均長(zhǎng)度約為568 bp，各菌株的ITS序列長(zhǎng)度統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表3。

2.4 菌株的分子鑒定結(jié)果與ITS序列系統(tǒng)進(jìn)化分析

根據(jù)BLAST比對(duì)結(jié)果，結(jié)合菌株的形態(tài)學(xué)特征，利用生物學(xué)軟件MEGA4.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。鑒定結(jié)果表明，ZH43和ZT49屬于曲霉屬；ZH38位于曲霉屬菌株鄰近的單獨(dú)分枝上，分枝結(jié)點(diǎn)的支持系數(shù)為100，親緣關(guān)系較近，認(rèn)為其可能為曲霉屬的潛在新種或變種（圖4）。BT4、MZ12、TJ29、TL37、ZH41、ZT44、ZT45鏈格孢屬；TJ26、TJ27位于鏈格孢屬菌株鄰近的單獨(dú)分枝的兩個(gè)側(cè)枝上，其分枝結(jié)點(diǎn)為63，認(rèn)為其可能為鏈格孢屬的兩個(gè)不同的潛在新種或變種（圖5）。TL35、TL36和ZT50屬于葡萄座腔菌屬；ZT46屬于脈紋孢菌屬（圖6）。

3 小結(jié)與討論

棗果儲(chǔ)存期病原真菌的傳統(tǒng)鑒定一般根據(jù)分生孢子形態(tài)、大小、分生孢子梗及菌落形態(tài)等形態(tài)學(xué)特征，結(jié)合其生理生化性狀作相關(guān)的描述。但是，有一些霉菌的形態(tài)學(xué)特征又因環(huán)境的差異而變化，不少霉菌培養(yǎng)性狀的可變性及形態(tài)特征的交叉，必然導(dǎo)致霉菌的分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)不可靠。故采用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定霉菌會(huì)產(chǎn)生一定的分歧，存在著一定的弊端。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，ITS分子標(biāo)記已被廣泛應(yīng)用于霉菌的屬內(nèi)不同種間或近似屬間的系統(tǒng)發(fā)育研究，為真菌的系統(tǒng)發(fā)育和分類(lèi)鑒定提供豐富的遺傳信息。本研究中，在菌種保存過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，繼代會(huì)造成菌株形態(tài)上不同程度的不穩(wěn)定性，以TJ29、ZH38和ZT45最為明顯；并且在菌株培養(yǎng)和菌種保存過(guò)程中，多數(shù)菌株不產(chǎn)孢，依靠序列分析對(duì)16個(gè)菌株進(jìn)行了鑒定、分類(lèi)，提高了鑒定的可靠性和準(zhǔn)確性。

國(guó)內(nèi)鄭曉蓮等[22]、徐祥彬等[23]、李冬霞[24]研究認(rèn)為，鏈格孢菌、橄欖色盾殼霉菌（Coniaothyrium olivaceum Bon）、聚生小穴殼菌（Dothriorella gregaria Sacc）、青霉菌（Penicillium expansum）、芽枝孢菌（Cladosporium tenuissimum）、七葉樹(shù)殼梭孢（Fusicoccum aesculi Corda）和莖點(diǎn)霉菌（Phoma sp.）是棗縮果病的病原真菌；王軍等[25]、李夏鳴等[26]研究認(rèn)為，引起棗果黑斑的病原為鏈格孢菌；劉春琴等[27]人研究認(rèn)為，囊孢殼菌（Physalosoora obtuse）、莖點(diǎn)霉菌和細(xì)鏈格孢菌是金絲小棗漿爛果病的致病菌。據(jù)國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道，在果實(shí)儲(chǔ)藏期，鏈格孢屬、莖點(diǎn)菌、玉米新月彎孢霉（Curvularia lunat）、多主枝孢霉（Cladosporium herbarum）可引起棗果斑點(diǎn)性病害；鐮刀菌、黑附球菌可引起棗果實(shí)腐爛[28]。本研究結(jié)果顯示鏈格孢屬9株，為優(yōu)勢(shì)菌群，與上述報(bào)道一致。3株為葡萄座腔菌屬（Botryosphaeria），該病原菌趙曉軍等[29]認(rèn)為是棗樹(shù)干腐病病原菌的致病真菌的無(wú)性階段。而本研究鑒定分離出來(lái)的曲霉屬及脈紋孢菌屬在國(guó)內(nèi)未見(jiàn)報(bào)道，另一棗果病原優(yōu)勢(shì)真菌群莖點(diǎn)霉菌在本研究中未發(fā)現(xiàn)。這可能是由于真菌鑒定時(shí)采用的方法不同所致，也可能與采樣在不同的年份、不同的栽培地、病蟲(chóng)害防治和管理手段的差異等有關(guān)，其不同的生態(tài)環(huán)境造成棗果表面分布不同的霉菌。本研究的樣品材料來(lái)自蒙自地區(qū)兩個(gè)規(guī)模較大的棗果生產(chǎn)基地，取材范圍較為狹窄，還應(yīng)擴(kuò)大篩選范圍，同時(shí)進(jìn)行多年取樣研究，從而進(jìn)一步驗(yàn)證以上結(jié)論。此外，本研究中所分離的引起棗果腐爛的霉菌來(lái)自?xún)山M樣標(biāo)，一組為采集時(shí)已腐爛的棗果，另一組為健康棗果，后者采樣后于4 ℃冰箱中貯存腐爛后無(wú)菌條件下進(jìn)行組織分離菌種，根據(jù)分離純化結(jié)果初步確定這些菌株與棗果的腐爛有關(guān)，而進(jìn)一步確認(rèn)其是否均為棗果腐爛的直接病原菌，還需于次年采集相應(yīng)品種的健康棗果做回接試驗(yàn)進(jìn)行后續(xù)研究進(jìn)一步確定。

本研究從云南蒙自地區(qū)的6個(gè)不同品種的棗果中分離得到16株致病霉菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)特征觀察和ITS序列分析鑒定其隸屬鏈格孢屬、曲霉屬、葡萄座腔菌屬和脈紋孢菌屬4個(gè)菌屬；其中鏈格孢屬9株，曲霉屬3株，葡萄座腔菌屬3株，脈紋孢菌屬1株。采用ITS序列分析結(jié)合形態(tài)學(xué)特征觀察可準(zhǔn)確、快速鑒定引起棗果腐爛的病原真菌，且結(jié)果可靠，可為棗果采收期或貯藏期腐爛霉菌的綜合防治研究提供一定的理論支持，同時(shí)還可為引起其他果蔬采收期或貯藏期的真菌性病原菌鑒定提供一定的參考。

從國(guó)內(nèi)外的研究報(bào)道可知，由病原微生物引起的棗果實(shí)病害棗縮果病和棗黑斑病的主要病原真菌為鏈格孢屬病原菌，該病原菌屬于半知菌亞門(mén)絲孢綱叢梗孢目黑色菌科，是農(nóng)作物的主要致病菌之一。全世界已報(bào)道的近500個(gè)鏈格孢屬病原真菌95%以上可兼性寄生于植物引起作物病害[30]，其代謝產(chǎn)物可導(dǎo)致受害植物產(chǎn)生諸如黑斑病、褐斑病、莖枯病等癥狀，對(duì)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)產(chǎn)生嚴(yán)重影響，從而造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。化學(xué)防治是防治由鏈格孢屬真菌引起的農(nóng)作物疫病的有效手段[31]。目前防治這些疫病的化學(xué)藥劑主要有代森錳鋅、異菌脲、三唑酮、嘧菌酯、腐霉利等[32]。但是由于這些藥劑的長(zhǎng)期使用使得部分地區(qū)的鏈格孢屬真菌已經(jīng)對(duì)一些殺菌劑產(chǎn)生了一定的抗藥性。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)鏈格孢屬的抗藥性的報(bào)道主要集中在農(nóng)作物上，引起棗縮果病和棗黑斑病的鏈格孢屬真菌的抗藥性篩選及作用機(jī)理在國(guó)內(nèi)外還鮮有報(bào)道。

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