鐵皮石斛組織培養(yǎng)研究進(jìn)展

摘要：鐵皮石斛（Dendrobium officinale）是中國的珍貴中藥材，目前，鐵皮石斛野生資源稀缺，組織培養(yǎng)是鐵皮石斛快速繁殖的有效途徑。近年來，鐵皮石斛組織培養(yǎng)上的研究主要有種子無菌萌發(fā)，外植體誘導(dǎo)原球莖發(fā)生、增殖與分化，在培養(yǎng)基上生根與壯苗等，大量研究表明，以鐵皮石斛莖段為外植體進(jìn)行組培更易獲得試管生根苗。原球莖增殖與分化最適基礎(chǔ)培養(yǎng)基是MS，NAA濃度為0.5 mg/L時(shí)，鐵皮石斛生根率為100%，且長勢良好，生長健壯。配以一定的添加物能使之更快形成幼苗。同時(shí)，幼苗壯苗以MS+IBA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L培養(yǎng)基為最佳，莖粗、苗高、葉長，效果最好。但是鐵皮石斛組織培養(yǎng)周期長是其快速繁殖中存在的主要問題，對此，建議可以通過遺傳變異、單倍體誘導(dǎo)、離體開花授粉等非常規(guī)育種方式，快速培育優(yōu)良品種，或者在進(jìn)行組織培養(yǎng)研究時(shí)，直接以組織培養(yǎng)物替代原藥材使用或者生產(chǎn)活性成分等方面進(jìn)行研究。

關(guān)鍵詞：鐵皮石斛（Dendrobium officinale）；組織培養(yǎng)；外植體誘導(dǎo)；原球莖

中圖分類號：S682.31；Q813.1+2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）01-0009-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.01.003

石斛是《中華人民共和國藥典》中記載的涉及植物來源最為眾多、應(yīng)用最為廣泛的一種中藥材，尤以鐵皮石斛（Dendrobium officinale）品質(zhì)最佳。其味甘，性微寒。歸胃經(jīng)、腎經(jīng)。具有益胃生津，滋陰清熱的功效。用于熱病津傷，口干煩渴，胃陰不足，食少干嘔，病后虛熱不退，陰虛火旺，骨蒸勞熱，目暗不明，筋骨痿軟[1]。鐵皮石斛的主要成分為石斛多糖和石斛堿，具有滋陰、益胃、生津止渴、潤肺止咳、強(qiáng)壯及增強(qiáng)免疫活性的作用[2，3]。鐵皮石斛主要集中在亞洲熱帶、亞熱帶和大洋洲等地區(qū)，目前中國有74種2變種，多分布于秦嶺以南的省份，主要分布于安徽、江西、浙江、福建、四川、廣西和云南等地，其中以云南的產(chǎn)量最大。生于樹干上或巖石間，海拔可達(dá)1 600多米，喜溫暖濕潤氣候和半陰半陽的環(huán)境，不耐寒。適宜在涼爽、濕潤、空氣暢通的環(huán)境生長[4]。陳青青等[5]研究指出，溫度和光照對鐵皮石斛的生長影響顯著，在25 ℃、光照度為1 500 lx時(shí)，最適宜鐵皮石斛生長；pH對鐵皮石斛的苗鮮重和生根率有顯著影響，以pH 5.4為宜。石斛種子極小，每個(gè)蒴果約有2萬粒，呈黃色粉末狀，通常不發(fā)芽，只在養(yǎng)分充足、濕度適宜、光照適中的條件下才能萌發(fā)生長，在自然狀態(tài)下發(fā)芽率極低[6]，生長環(huán)境極為苛刻，使有性繁殖變得極為艱難，何平榮等[7]研究表明，鐵皮石斛的自然有性繁殖的結(jié)實(shí)率極低，僅為0.31%。而近年來過度地采挖野生的藥材和對其生境的不斷破壞，野生鐵皮石斛已面臨瀕危。鑒于此種情況，利用組織培養(yǎng)進(jìn)行鐵皮石斛大量的繁殖生產(chǎn)，能使鐵皮石斛得到更好的保護(hù)和發(fā)展。本文就近年來鐵皮石斛組培快繁技術(shù)的研究現(xiàn)狀進(jìn)行了綜述，包括外植體的選擇，不同基本培養(yǎng)基、激素、添加物對其增殖與分化的影響，以及生根壯苗的方法等，以期為實(shí)現(xiàn)鐵皮石斛的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

鐵皮石斛通過組織培養(yǎng)獲得再生植株的主要途徑有兩種：一是用成熟的種子通過消毒處理，以無菌萌發(fā)的方式產(chǎn)生種苗或原球莖，增殖分化后發(fā)育成植株。二是誘導(dǎo)適宜外植體（莖段、莖尖、幼芽、葉片等）形成類原球莖或叢生芽來實(shí)現(xiàn)快速繁殖，從而獲得大量再生植株[8]。

1 鐵皮石斛的種子無菌萌發(fā)途徑

1.1 種子胚齡

不同胚齡的鐵皮石斛種子萌發(fā)率不同。胚齡時(shí)間越長，其萌發(fā)率越高。冉懋雄[9]在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)120 d胚齡的細(xì)胞數(shù)為90個(gè)，萌發(fā)率95%以上，組織培養(yǎng)的最適胚齡以種子成熟時(shí)較好。溫明霞[10]等研究結(jié)果表明，由種子誘導(dǎo)的愈傷組織分化能力較強(qiáng)，由種胚培養(yǎng)的原球莖的質(zhì)量也較高，但種齡愈長，萌發(fā)時(shí)間愈短，萌發(fā)率愈高。

1.2 培養(yǎng)基

培養(yǎng)基的種類、成分等直接影響鐵皮石斛的生長發(fā)育，選擇合適的培養(yǎng)基，對于鐵皮石斛的組織培養(yǎng)是至關(guān)重要的。不同的培養(yǎng)途徑所用的培養(yǎng)基也會有所不同。以種胚作為培養(yǎng)材料，李榮珍[11]認(rèn)為鐵皮石斛種子在不同激素的培養(yǎng)基上均能萌發(fā)；不同培養(yǎng)基對鐵皮石斛原球莖的增殖、分化有明顯差異，其順序依次為改良MS>N6>MS>1/2N6>1/2改良MS>1/2 MS，以改良MS培養(yǎng)基最好；而鄭志仁等[12]的試驗(yàn)顯示鐵皮石斛種子在MS、1/2 MS培養(yǎng)基上萌發(fā)率較高，在KC培養(yǎng)基上次之，均達(dá)到80%以上，而在B5、N6培養(yǎng)基上較低。余樂等[13]研究表明1/2 MS培養(yǎng)基是最適合鐵皮石斛種子無菌萌發(fā)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。雖然不同培養(yǎng)基對鐵皮石斛種子萌發(fā)的影響不盡相同，但是大多數(shù)學(xué)者的研究都表明以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基是最適合鐵皮石斛種子無菌萌發(fā)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

1.3 激素與添加劑

植物組織培養(yǎng)中所用到的激素類型主要分為細(xì)胞分裂素和生長素，運(yùn)用到鐵皮石斛組織培養(yǎng)中的激素主要有：6-BA、NAA、KT、IBA、IAA等。黃昌艷等[14]認(rèn)為適宜種子萌發(fā)的較好培養(yǎng)基為MS+20%馬鈴薯泥，芽增殖最適培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg/L，增殖率達(dá)282.7%；最適生根培養(yǎng)基為MS+15%香蕉泥，生根率達(dá)100%。唐桂香等[15]的研究表明添加20%馬鈴薯液有利于種胚的萌發(fā)，種胚萌發(fā)率為79.37%；BA 1.0 mg/L和NAA 0.1 mg/L最有利于原球莖增殖，培養(yǎng)基中添加2%活性碳原球莖增殖倍數(shù)高；NAA有助于試管苗的生根，不同含量NAA以0.5 mg/L時(shí)試管苗平均根數(shù)最多和平均根長最長。

在添加劑的使用時(shí)，白美發(fā)等[16]認(rèn)為以椰子汁為附加物時(shí)，對鐵皮石斛苗的增殖促進(jìn)作用最大，香蕉泥和馬鈴薯泥的增殖效果相近。鄭寬瑜等[17]研究表明添加香蕉泥能明顯促進(jìn)不定芽生根，并且苗生長旺盛，根莖生長健壯。鄧瑞云等[18]又進(jìn)一步驗(yàn)證了這一結(jié)論，香蕉汁對鐵皮石斛壯苗生根影響較大。當(dāng)不添加任何外源添加物時(shí)，小苗生長較緩慢，小苗瘦弱，根系不發(fā)達(dá)，幾乎無根或是根稀少。當(dāng)添加了香蕉汁后，小苗生長較快，植株健壯，根系發(fā)達(dá)。當(dāng)添加物的濃度不一樣時(shí)，種子萌發(fā)情況也不一樣。張桂芳等[19]在研究中指出馬鈴薯提取液以10%濃度時(shí)最佳，濃度為20%時(shí)已表現(xiàn)出抑制作用，且原球莖個(gè)小，若是成簇原球莖時(shí)，則結(jié)構(gòu)致密；椰乳也以10%濃度最佳，濃度為20%時(shí)反而不利于種胚萌發(fā)，且原球莖的長勢差，這可能是這些附加物中含有一定濃度的植物激素，適當(dāng)濃度促進(jìn)種胚生長，濃度超過一定水平時(shí)就表現(xiàn)出抑制作用。

2 鐵皮石斛的外植體誘導(dǎo)原球莖發(fā)生途徑

2.1 選擇與消毒

在鐵皮石斛的組織培養(yǎng)中，除上述所說的種子作為外植體培養(yǎng)外，還可以鐵皮石斛的莖尖[20-22]、莖段[23-29]、蒴果[30]、帶芽莖段[31]、叢生芽[32]、幼葉[33]誘導(dǎo)原球莖發(fā)生。

不同的消毒方法對外植體誘導(dǎo)效果也不一樣。王春等[20]以莖尖作為外植體，先用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇脫脂藥棉擦洗整個(gè)帶葉和葉鞘的幼莖，再剝?nèi)ハ虏咳~和葉鞘，留下包裹莖尖的1～2片葉，在1 g/L升汞（加2滴吐溫20）中浸泡8 min，100 g/L的NaClO溶液中20 min，蒸餾水洗4～5次，用刀背擠出莖尖接種，外植體莖尖存活率可達(dá)76.2%。鄒娜等[34]以莖段為外植體，剪去多余的葉片，蘸洗潔精仔細(xì)刷洗枝條表面，水流下沖洗20 min，用70%的乙醇浸泡10～30 s，取出材料后用含吐溫20 的0.1% HgCl2溶液分別劇烈振蕩消毒6 min和8 min，無菌水沖洗5遍，結(jié)果顯示出外植體滅菌8 min或6 min污染率相當(dāng)，污染率可控制在50%以下。

2.2 原球莖增殖與分化

鐵皮石斛組織培養(yǎng)的周期較長，所以不同階段的培養(yǎng)基也有所不同，增殖與分化所用的培養(yǎng)基與種子萌發(fā)所用的培養(yǎng)基也不一樣。戚華沙等[32]以鐵皮石斛叢生芽作為外植體，用不同濃度的兩種生長素和不同的添加物以及不同濃度的活性炭研究出以MS培養(yǎng)基+0.5 mg/L 6-BA+ 0.2 mg/L NAA+30 g/L 糖+6.5 g/L 瓊脂+0.5 g/L活性炭，添加10%的香蕉泥作為天然附加物，是鐵皮石斛叢生芽增殖的最佳培養(yǎng)基。蔣向輝等[33]以鐵皮石斛幼葉為外植體，比較不同種類、濃度的激素對鐵皮石斛的幼葉直接成苗和產(chǎn)生愈傷組織的影響，得出愈傷誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.25 mg/L+NAA 1.5 mg/L；芽分化的最適培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.8 mg/L。周俊輝等[28]與詹忠根[35]分別以無菌幼苗莖段為外植體，得出以B5作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基再進(jìn)行不同激素和添加物的配比的效果最好。李澤生等[29]以一年生鐵皮石斛莖段為外植體，通過篩選不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基，研究出以1/2MS為較好，再進(jìn)行不同植物生長素和細(xì)胞分裂素以及添加物的配比，得出1/2 MS+NAA 5.0 mg/L+6-BA 2.0 mg/L是最適合叢芽分化的誘導(dǎo)培養(yǎng)基；在培養(yǎng)基中添加香蕉10%+洋芋10%生根多，瓶苗長勢好。張啟香等[22]以鐵皮石斛的莖尖為外植體，誘導(dǎo)產(chǎn)生原球莖，進(jìn)一步培養(yǎng)形成幼苗，其結(jié)果表明，原球莖誘導(dǎo)以1/2MS+6-BA 0.3 mg/L +KT 0.1 mg/L+LH 1.0 g/L為最優(yōu)。

2.3 生根與壯苗

鐵皮石斛的組織培養(yǎng)成功與否的衡量標(biāo)準(zhǔn)之一就是愈傷組織的生根與發(fā)芽。誘導(dǎo)鐵皮石斛生根的基礎(chǔ)培養(yǎng)基主要有MS、1/2MS、N6和B5。而有相關(guān)研究表明，在不加入激素的播種培養(yǎng)基上鐵皮石斛種苗會自動生根，但添加香蕉汁、蔗糖、活性炭等對生根壯苗有明顯的促進(jìn)作用[14，36-38]，而添加激素會極大地影響生根。李璐等[39]以離體保存5年的鐵皮石斛原球莖為材料，采用正交試驗(yàn)對其試管苗壯苗生根的條件進(jìn)行優(yōu)化，從鮮重、假鱗莖、顏色、株高和根系生長等方面對植株進(jìn)行綜合評定。其研究結(jié)果表明：適宜鐵皮石斛壯苗生根的培養(yǎng)基為1/2 MS+10 g/L白糖。陳兆貴等[40]通過不同激素配比得出壯苗生根以1/2MS+IBA 2.0 mg/L十水解酪蛋白500 mg/L+10%香蕉提取液為最佳，45 d生根率達(dá)92%。洪森榮等[41]研究認(rèn)為，不添加任何植物激素的MS對鐵皮石斛帶芽莖段根的分化最為有利，但添加了KT和NAA后，對芽的分化有促進(jìn)作用，細(xì)胞分裂素KT與生長素NAA配比高的培養(yǎng)基，繁殖系數(shù)高，配比低則繁殖系數(shù)也低。郭洪波等[42]和李小軍等[43]都認(rèn)為添加香蕉泥對石斛試管苗的生根有利，可以促使幼苗生根時(shí)間提前。

3 展望

組織培養(yǎng)最大的優(yōu)點(diǎn)就是能在快速和大量繁殖個(gè)體的同時(shí)保持母本的優(yōu)良性狀[44]，因此對于鐵皮石斛有性繁殖困難，在其中開展組織培養(yǎng)研究是十分必要的，而鐵皮石斛的組織培養(yǎng)主要解決的問題就是組培周期長的問題，大量試驗(yàn)研究表明，以鐵皮石斛莖段為外植體進(jìn)行組培更易獲得試管生根苗。原球莖增殖與分化最適基礎(chǔ)培養(yǎng)基是MS，NAA濃度為0.5 mg/L時(shí)，鐵皮石斛生根率為100%，且長勢良好，生長健壯。并配以一定的添加物能使之更快形成幼苗。同時(shí)，幼苗壯苗以MS+IBA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L培養(yǎng)基為最佳，莖粗、苗高、葉長，效果最好[45]。

目前，中國在鐵皮石斛組織培養(yǎng)技術(shù)方面取得了突破性的進(jìn)展，但是組織培養(yǎng)周期長，需要一定的設(shè)備，并且耗費(fèi)一定的人力和物力，我們還需加強(qiáng)組培育種的研究工作，通過遺傳變異、單倍體誘導(dǎo)、離體開花授粉等非常規(guī)育種方式，快速培育優(yōu)良品種。另外，在進(jìn)行組織培養(yǎng)研究時(shí)，直接以組織培養(yǎng)物替代原藥材使用或者生產(chǎn)活性成分也是解決鐵皮石斛資源短缺的方法之一，但目前涉及該方面的研究還很少，同時(shí)在鐵皮石斛組織培養(yǎng)過程中所添加的各種物質(zhì)對其藥用成分的影響也同樣值得繼續(xù)探索。

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