基于gyrB基因的地衣芽孢桿菌PCR快速檢測(cè)方法的建立

李天芝，于新友，李書光,2，苗立中,2，沈志強(qiáng),2*

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600 2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600）

基于gyrB基因的地衣芽孢桿菌PCR快速檢測(cè)方法的建立

李天芝1，于新友1，李書光1,2，苗立中1,2，沈志強(qiáng)1,2*

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600 2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600）

根據(jù)地衣芽孢桿菌的gyrB基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，擴(kuò)增片段大小為507 bp的基因片段，該方法對(duì)地衣芽孢桿菌DNA的擴(kuò)增結(jié)果為陽性，對(duì)照菌株擴(kuò)增結(jié)果均為陰性，對(duì)地衣芽孢桿菌檢測(cè)的靈敏性為1 pg總DNA量，成功建立了地衣芽孢桿菌PCR檢測(cè)方法，該方法具有快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，為地衣芽孢桿菌的分離及鑒定奠定了良好的基礎(chǔ)。

地衣芽孢桿菌；gyrB基因；PCR

地衣芽孢桿菌對(duì)葡萄球菌、酵母樣菌等致病菌有頡頏作用，而對(duì)雙歧桿菌、乳酸桿菌、擬桿菌、消化性鏈球菌有促進(jìn)生長(zhǎng)作用，從而可通過調(diào)整菌群失調(diào)達(dá)到治療目的，還可促使機(jī)體產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)、殺滅致病菌。此外，地衣芽孢桿菌還可通過奪氧生物效應(yīng)使腸道內(nèi)缺氧，有利于大量厭氧菌生長(zhǎng)，造成腸道低氧環(huán)境，對(duì)腸道內(nèi)的雙歧桿菌、乳酸桿菌、擬桿菌、消化鏈球菌等有益健康的厭氧菌生長(zhǎng)繁殖有促進(jìn)作用，對(duì)葡萄球菌、白色念球菌、酵母樣菌等致病菌則有頡頏作用。通過這種雙重作用可以調(diào)整腸道菌群失調(diào)，維持機(jī)體腸道微生態(tài)平衡，從而對(duì)腸道疾病達(dá)到治療和預(yù)防的目的。普遍存在于細(xì)菌中的單拷貝gyrB基因，是編碼促旋酶B亞單位的基因。gyrB基因能不斷進(jìn)化，替換0.7%～0.8%的堿基大約需要的時(shí)間是100萬年，可作為細(xì)菌鑒定的一種靶基因，這一點(diǎn)已經(jīng)得到專家學(xué)者的認(rèn)可[1-2]。目前，gyrB基因已經(jīng)廣泛應(yīng)用于多種細(xì)菌種屬的快速鑒定，如巴氏肺炎球菌、芽孢桿菌屬、苯酚分解菌和蛭弧菌屬[3]。本試驗(yàn)參照地衣芽孢桿菌gyrB基因序列，設(shè)計(jì)1對(duì)引物，對(duì)PCR反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，建立地衣芽孢桿菌的PCR快速檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 菌株、試劑和試劑盒

地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、弗氏弧菌均由山東綠都生物科技有限公司實(shí)驗(yàn)室保存，馬丁肉湯培養(yǎng)基購自北京中海生物科技有限公司，Taq DNA聚合酶購自大連寶生物工程有限公司，細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司。

1.2 PCR引物設(shè)計(jì)和合成

參照Genbank登錄的地衣芽孢桿菌gyrB基因序列（DQ309295），用Primer primer 5.0軟件分析后，設(shè)計(jì)1對(duì)引物，gyrB-F：5'-GCCGGCTTCATGGG TTCCG-3'，gyrB-R:5'-GCGTCGGTGCTTCTGTTG-3'，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 PCR模板制備

將地衣芽孢桿菌接種于馬丁肉湯，37℃培養(yǎng)18～20 h，離心沉淀菌體用磷酸鹽緩沖液離心洗滌2次后，提取其基因組DNA，按照百泰克細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書提供的方法進(jìn)行操作，同時(shí)提取其他幾種對(duì)照菌的DNA作為模板。

1.4 PCR反應(yīng)體系和條件的優(yōu)化

PCR反應(yīng)體系：10×緩沖液2.5 μL，dNTP 2 μL，引物上、下游各1 μL，DNA模板1 μL，Taq DNA聚合酶0.25 μL，ddH2O補(bǔ)至25 μL。然后對(duì)退火溫度進(jìn)行優(yōu)化（48～58℃梯度溫度，每2℃為1個(gè)梯度），最后確定反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃5 min，94℃30 s，54℃30 s，72℃30 s，從94℃開始30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。

1.5 PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)和測(cè)序分析

取PCR產(chǎn)物5 μL，用瓊脂糖凝膠1.2%電泳進(jìn)行檢測(cè)，回收目的基因，連接pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，將經(jīng)PCR鑒定陽性菌落，搖菌，提取質(zhì)粒，送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定，并將測(cè)出的序列與GenBank中參照的的地衣芽孢桿菌gyrB基因序列進(jìn)行相似性比較。

1.6 特異性檢測(cè)

分別提取地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、弗氏弧菌等6種細(xì)菌的基因組DNA作為模板，用已建立的方法進(jìn)行擴(kuò)增。

1.7 敏感性檢測(cè)

用核酸濃度測(cè)定儀測(cè)定制備的地衣芽孢桿菌基因組DNA的濃度后，10倍系列稀釋DNA，使其分別相當(dāng)于含有DNA 10 ng、1 ng、100 pg、10 pg、1 pg、0.1 pg，分別作為模板，做PCR擴(kuò)增，檢驗(yàn)檢測(cè)方法的敏感性。

1.8 重復(fù)性檢驗(yàn)

用建立的PCR檢測(cè)方法，對(duì)地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、弗氏弧菌的DNA，重復(fù)檢測(cè)3次，以驗(yàn)證本方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR產(chǎn)物的檢測(cè)和序列鑒定

用1.2%瓊脂糖凝膠電泳方法檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，結(jié)果在507 bp出現(xiàn)一條特異性條帶，見圖1。

圖1 地衣芽孢桿菌PCR擴(kuò)增結(jié)果

將PCR產(chǎn)物連接pMD18-T載體后，進(jìn)行測(cè)序，測(cè)得的序列如下：

將該序列與GenBank登錄地衣芽孢桿菌（登錄號(hào)：DQ309295）的序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果表明，兩序列的相似性為100%。

2.2 特異性檢測(cè)

PCR擴(kuò)增結(jié)果表明，只有地衣芽孢桿菌出現(xiàn)了507 bp的擴(kuò)增條帶（預(yù)期大小為507 bp），對(duì)照菌的PCR擴(kuò)增均無條帶。因此，該引物對(duì)地衣芽孢桿菌具有較強(qiáng)的特異性，特異性試驗(yàn)見圖2。

圖2 特異性試驗(yàn)

2.3 敏感性檢測(cè)

分別取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL，用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，由檢測(cè)結(jié)果可知，該P(yáng)CR方法最低可檢測(cè)1 pg地衣芽孢桿菌基因組DNA的量，敏感性檢測(cè)見圖3。

圖3 敏感性試驗(yàn)

2.4 重復(fù)性檢驗(yàn)

3次重復(fù)性的試驗(yàn)結(jié)果均無差別，表明建立的檢測(cè)方法穩(wěn)定且具有良好的可重復(fù)性。

3 討論

傳統(tǒng)的地衣芽孢桿菌實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法（病原分離與生化鑒定等）操作復(fù)雜，耗時(shí)長(zhǎng)，也可用多位點(diǎn)可變分析法、real-time PCR等進(jìn)行檢測(cè)[4-5]。然而這些檢測(cè)方法相對(duì)普通PCR有較高的要求，需要特殊的儀器設(shè)備，不能滿足基層工作者對(duì)地衣芽孢桿菌的快速檢測(cè)鑒定的需求。李宏等根據(jù)地衣芽孢桿菌的gyrB基因序列設(shè)計(jì)了1對(duì)特異性引物，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為303 bp，以此引物對(duì)為基礎(chǔ)，成功建立了靈敏度為1×10-3mg·L－1的地衣芽孢桿菌PCR檢測(cè)方法[6]。

本試驗(yàn)參照Genbank中登錄的地衣芽孢桿菌gyrB基因，對(duì)序列進(jìn)行分析，設(shè)計(jì)1對(duì)引物，對(duì)地衣芽孢桿菌PCR檢測(cè)方法進(jìn)行優(yōu)化，分別采用48、50、52、54、56、58℃等6個(gè)不同的退火溫度，得到PCR擴(kuò)增反應(yīng)最佳的退火溫度是54℃，該法只對(duì)地衣芽孢桿菌的核酸有特異性擴(kuò)增條帶，對(duì)枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、弗氏弧菌的擴(kuò)增結(jié)果均為陰性，該P(yáng)CR檢測(cè)地衣芽孢桿菌靈敏度可以達(dá)到1 pg DNA。試驗(yàn)結(jié)果表明，該檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便，敏感性高，實(shí)用性強(qiáng)，且有較高的特異性，能快速從多種細(xì)菌中鑒定出地衣芽孢桿菌。

[1] Fukushima M,Kakinuma K,Hayashi H,et al.Detection and identification of Mycobacterium species isolates by DNA microarray [J].Journal of Clinical Microbiology,2003,41（6）:2 605-2 615.

[2] 李獻(xiàn)梅,王小芬,楊洪巖,等.促旋酶（gyrase）B亞單位基因gyrB在鑒別細(xì)菌近緣種中的應(yīng)用[J].微生物學(xué)報(bào),2008,48（5）: 701-706.

[3] 侯曉麗,陳智.分類及鑒別細(xì)菌的新靶標(biāo)—gyrB基因[J].國外醫(yī)學(xué)·流行病學(xué)傳染病學(xué)分冊(cè),2005,32（2）:38-41.

[4] Dhakal R,Chauhan K,Seale R B,et al.Genotyping of dairy Bacillus licheniformis isolates by high resolution melt analysis of multiple variable number tandem repeat loci[J].Food Microbiology, 2013,34（2）:344-351.

[5] De Clerck E,Vanmol K,Jannes G,et al.Design of a 5,exonuclease-based real-time PCR assay for simultaneous detection of Bacillus licheniformis,members of the'B.cereus group'and B.fumarioli in gelatine[J].Letters in Applied Microbiology,2004,39 （1）:109-115.

[6] 李宏,吳海武,孟凡同,等.基于gyrB基因的地衣芽孢桿菌PCR快速檢測(cè)方法的建立[J].海南大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版, 2013,31（3）:230-233.

Development of A PCR Method for Rapid Detection of Bacillus LicheniformisBased ongyrBGene

LI Tianzhi1,YU Xinyou1,LI Shuguang1,2,MIAO Lizhong1,2,SHEN Zhiqiang1,2*

（1.Shandong Green Biological Technology Co.,Ltd.,Binzhou 256600,Shandong China;
2.Shandong Binzhou Animal Science and Veterinary Medicine Academy,Binzhou 256600,Shandong China）

In this study,based on gyrB gene sequences from Bacillus licheniformis,a pair of specific primers was designed.The size of the amplified product were 507 bp.The amplified results from Bacillus DNA were positive,but the results were negative from control strain.The sensitivity for Bacillus licheniformis was 1pg DNA.A PCR method for detection of Bacillus licheniformis was established.The method had the advantages of high-efficiency, high-sensitivity and high-specificity,and which set a good foundation for isolating Bacillus licheniformis from a complex microbial community samples．

Bacillus licheniformis;gyrB gene;PCR

S917.1

A

1001-0084（2015）03-0029-03

2015-01-23

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(SDAIT-06-011-14)

李天芝（1985-），女，山東菏澤人，碩士，助理研究員，主要從事動(dòng)物傳染病診斷技術(shù)研究。