褐變抑制劑對(duì)蘋果多酚氧化酶抑制機(jī)理研究

易建華 董新玲 朱振寶 趙雪萌

（陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 西安 710021）

蘋果汁是人們喜愛(ài)的果蔬汁之一，近年來(lái)，中國(guó)蘋果汁的產(chǎn)量增加很快。在世界貿(mào)易中，濃縮蘋果汁的貿(mào)易量逐年提高［1］。然而在加工和貯藏的過(guò)程中，蘋果汁易發(fā)生褐變反應(yīng)，由誘人的金黃色變成棕褐色，色值下降、感官品質(zhì)劣變，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值降低［2］。果汁的褐變主要是由酶促褐變引起的，這一直是采后生理研究的重點(diǎn)。酶促褐變是在氧氣參與條件下，果蔬中的多酚物質(zhì)經(jīng)PPO催化變色所致［3］。PPO是發(fā)生酶促褐變的主要酶，存在于大多數(shù)果蔬中。鑒于PPO對(duì)蘋果汁品質(zhì)的不利作用，果汁生產(chǎn)過(guò)程中常采用抑制劑抑制PPO的活性，從而達(dá)到控制褐變的目的，因此，研究褐變抑制劑對(duì)蘋果多酚氧化酶的抑制機(jī)理具有重要意義。

酶促褐變的發(fā)生需要3個(gè)條件，即適當(dāng)?shù)姆宇惖孜铩⒎友趸负脱?。在控制酶促褐變?cè)囼?yàn)過(guò)程中，通過(guò)除去底物抑制褐變的可能性很小，有研究者［4］曾設(shè)想改變酚類底物的結(jié)構(gòu)，但目前為止未取得成功。實(shí)踐中控制酶促褐變的方法主要是添加抑制劑影響酶活性。根據(jù)抑制劑與酶的作用是否可逆，通常將抑制作用分為不可逆抑制和可逆抑制兩類，可逆抑制作用除了競(jìng)爭(zhēng)性抑制、非競(jìng)爭(zhēng)性抑制和反競(jìng)爭(zhēng)性抑制以外，還有混合型抑制劑，混合型抑制劑包括兩種類型：非競(jìng)爭(zhēng)性和反競(jìng)爭(zhēng)性混合抑制，非競(jìng)爭(zhēng)性和競(jìng)爭(zhēng)性混合抑制［4］。

目前國(guó)內(nèi)外已研究出多種褐變抑制劑，其中4－HR、谷胱甘肽、β－CD、有機(jī)鈣鹽、半胱氨酸和植物提取物等是研究較多的 新 型 褐 變 抑 制 劑。Alvarez－Parrilla等［5］發(fā) 現(xiàn) β－CD 與4－HR有很好的協(xié)助作用，這兩種抑制劑聯(lián)合使用對(duì)PPO活力的抑制效果比單獨(dú)使用要好，但具體的抑制機(jī)理目前尚不清楚。趙堅(jiān)華等［6］研究抑制劑對(duì)蘋果梨中多酚氧化酶的抑制作用表明，蘋果梨中多酚氧化酶的最佳抑制劑是谷胱甘肽，可以有效抑制活力，當(dāng)谷胱甘肽濃度為300μmol/L時(shí)，多酚氧化酶的活力降到50%，當(dāng)濃度增大到500μmol/L時(shí)，多酚氧化酶完全失去活力。周會(huì)玲等［7］對(duì)不同品種蘋果汁的褐變及其抑制方法的研究表明，對(duì)黃元帥蘋果汁用0.32g/L的Vc、對(duì)喬納金蘋果汁用0.48g/L的Vc在榨汁時(shí)進(jìn)行處理能較好地抑制褐變。然而有關(guān)常用抑制劑的機(jī)理沒(méi)有做出系統(tǒng)的研究。

有研究［8－10］認(rèn)為，綠原酸、兒茶素是PPO的良好褐變底物，是引起果實(shí)褐變的主要酚類物質(zhì)。本研究擬以綠原酸緩沖液為蘋果汁的模擬體系，測(cè)定不同濃度4－己基間苯二酚、草酸、植酸和苯甲酸對(duì)酶活的影響，通過(guò)對(duì)酶反應(yīng)速率和底物濃度做Lineweaver－Burk雙倒數(shù)圖，對(duì)比4種抑制劑的抑制動(dòng)力學(xué)，判定各抑制劑的抑制類型，為果汁褐變抑制劑的選擇和使用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

富士蘋果：購(gòu)于當(dāng)?shù)厮袌?chǎng)（每個(gè)樣品盡量均勻一致）；

綠原酸：純度85%，西安楚康責(zé)任有限公司；

鄰苯二酚、檸檬酸、磷酸氫二鈉等：分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；

對(duì)甲氧基苯甲酸：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

草酸：分析純，天津市天力化學(xué)試劑有限公司；

植酸：生化試劑，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

九陽(yáng)料理機(jī)：JYL－C020型，山東九陽(yáng)股份有限公司；

高速低溫離心機(jī)：CT15RT型，上海天美生化儀器設(shè)備工程有限公司；

精密酸度計(jì)：PB－10型，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：GZX－GF－101－3－5型，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；

電子天平：BS323S型，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；

漩渦混合器：QL－901型，海門市其林貝兒儀器制造有限公司；

磁力攪拌器：JBZ－14H型，上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司；

紫外可見分光光度計(jì)：UV759S型，上海荊和分析儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蘋果PPO的提取 將低溫下冷藏的新鮮蘋果清洗、去皮、切成小塊，稱取150g果肉放入料理機(jī)中，立刻加入300mL含2%聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）pH 6.8的磷酸鹽緩沖液（4℃預(yù)冷）進(jìn)行榨汁。濁汁于4℃、12 000r/min離心30min，取上清液，加入500mL丙酮（4℃預(yù)冷），攪拌待沉淀產(chǎn)生，置于4℃、12 000r/min離心15min，取沉淀物，冷凍干燥，再加入含1%Tween－80的磷酸鹽緩沖液，再次離心15min，得上清液，即為 PPO 粗酶液［11］。

將粗酶液加入到95%的（NH4）2SO4溶液中，在4℃下靜置2h，然后于12 000r/min離心30min，將所得沉淀溶于10mL pH 6.50的磷酸緩沖液中，置于4℃透析24h，期間換透析液4次［12］。

1.2.2 蘋果PPO活性測(cè)定 根據(jù)文獻(xiàn)［13］。

1.2.3 抑制劑對(duì)PPO酶促反應(yīng)的抑制作用 用pH 6.50的磷酸緩沖液分別配制不同濃度的4－HR（0.05，0.1，0.2，0.5mmol/L）和底物綠原酸（0.1，0.5，1，5，10mmol/L）溶液，于比色皿中加入0.3mL濃度為0.05mmol/L 4－HR，再加入0.3mL（純化）PPO酶液（體系總酶活為10U），平衡10min后加入2.4mL濃度0.1mmol/L綠原酸溶液，并開始計(jì)時(shí)，于420nm下每隔15s測(cè)定吸光值A(chǔ)，連續(xù)測(cè)定3min。改變底物濃度和抑制劑濃度，測(cè)定不同濃度抑制劑對(duì)酶活力的影響，做3組平行試驗(yàn)。以酶促反應(yīng)速率（每秒吸光值的變化）與底物濃度之間的動(dòng)力學(xué)關(guān)系作圖，研究酶促反應(yīng)遵循米氏（Michaelis－Menten）動(dòng)學(xué)方程，并做 Lineweaver－Burk雙倒數(shù)圖，判斷抑制劑的抑制類型［14］。草酸、植酸和苯甲酸試驗(yàn)方法同上。

2 結(jié)果與分析

2.1 4－HR對(duì)蘋果汁模擬體系酶促褐變的抑制作用

4－HR對(duì)綠原酸模擬果汁酶促褐變的抑制作用及其機(jī)理見圖1。由圖1（a）可知，底物濃度一定時(shí)，酶促反應(yīng)速率隨4－HR濃度的增大而降低。從圖1（b）可以看出，Lineweaver－Burk雙倒數(shù)是一組縱軸截距不變的直線，即酶促反應(yīng)最大速率（V）不變，但米氏常數(shù)（K）隨著4－HR濃度增大而變大，說(shuō)明4－HR是PPO的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。這與Alvarez－Parrilla等［5］的研究結(jié)果一致。

圖1 4－HR對(duì)蘋果汁模擬體系中PPO的抑制作用Figure 1 The inhibition of 4－HR on apple PPO

2.2 草酸對(duì)蘋果汁模擬體系酶促褐變的抑制作用

草酸對(duì)綠原酸模擬果汁酶促褐變的抑制作用及其機(jī)理見圖2。由圖2（a）可知，底物濃度一定時(shí)，隨著草酸濃度的增大，酶促反應(yīng)逐漸降低。由圖2（b）可知，Vmax不變，Km隨著抑制劑濃度的增大而增大，說(shuō)明草酸對(duì)PPO的抑制能力表現(xiàn)為濃度依賴性，即濃度越大，抑制作用越強(qiáng)，對(duì)PPO的抑制屬于競(jìng)爭(zhēng)性抑制，宋連軍等［15］研究表明草酸對(duì)PPO的抑制機(jī)理表現(xiàn)為不可逆效應(yīng)，與本試驗(yàn)結(jié)果有所不同。而S.M.Son等［16］研究表明，不同兒茶素濃度下，酶促褐變速率隨草酸濃度的增大而降低，抑制類型屬于競(jìng)爭(zhēng)性抑制，這與本試驗(yàn)結(jié)果一致。

圖2 草酸對(duì)蘋果汁模擬體系中PPO的抑制作用Figure 2 The inhibition of oxalic acid on apple PPO

2.3 植酸對(duì)蘋果汁模擬體系酶促褐變的抑制作用

植酸（肌醇六磷酸）是一種很強(qiáng)的抑制劑［12］，具有12個(gè)羧基，能夠通過(guò)與金屬螯合作用來(lái)抑制多酚氧化酶的活性［17］。雖然有報(bào)道指出植酸對(duì)果蔬汁有護(hù)色效果，但目前關(guān)于植酸在蘋果汁中的應(yīng)用研究不深入，趙玉生等［18］研究表明，植酸及其鹽天然無(wú)毒，是理想的植物性食品護(hù)色保鮮劑，應(yīng)積極推廣。

本試驗(yàn)研究植酸對(duì)模擬果汁酶促褐變的抑制作用及其機(jī)理見圖3。由圖3（a）可知，加入植酸后酶促反應(yīng)速率明顯降低，且隨著植酸添加量的增加，酶促反應(yīng)速率逐漸降低，該研究結(jié)果與宋連軍等［19］的研究結(jié)果一致。由圖3（b）可知，加入植酸后，酶促反應(yīng)的Vmax增大，Km降低，不符合可逆抑制類型中的任一模式，可見，植酸對(duì)PPO的作用屬于混合型抑制。

2.4 苯甲酸對(duì)蘋果汁模擬體系酶促褐變的抑制作用

圖3 植酸對(duì)蘋果汁模擬體系中PPO的抑制作用Figure 3 The inhibition of phytic acid on apple PPO

圖4 苯甲酸對(duì)蘋果汁模擬體系中PPO的抑制作用Figure 4 The inhibition of benzoic acid on apple PPO

苯甲酸對(duì)綠原酸模擬果汁體系褐變的抑制動(dòng)力學(xué)見圖4。由圖4可知，酶促反應(yīng)中加入苯甲酸后，最大反應(yīng)速率Vmax變小，Km不變；不同濃度抑制劑的雙倒數(shù)直線相交于橫軸，縱軸截距因抑制劑的存在而變大，抑制分?jǐn)?shù)與抑制劑濃度成正比，與底物濃度無(wú)關(guān)，說(shuō)明苯甲酸是PPO的非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，這與黃曉丹等［20］研究結(jié)果一致，即苯甲酸能抑制蘑菇酪氨酸酶的單酚酶和二酚酶的活性，其效應(yīng)為可逆抑制效應(yīng)，苯甲酸對(duì)二酚酶的抑制作用表現(xiàn)為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制。

3 結(jié)論

4－HR、草酸、植酸和苯甲酸對(duì)PPO酶催化綠原酸模擬果汁體系褐變均有抑制作用。不同抑制劑對(duì)含綠原酸模擬果汁中PPO抑制機(jī)理不同。4－HR和草酸對(duì)PPO抑制作用為競(jìng)爭(zhēng)性抑制，植酸為混合性抑制，苯甲酸酶為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制。本試驗(yàn)只對(duì)蘋果中含量較多的綠原酸酶促褐變抑制機(jī)理進(jìn)行研究，而蘋果中多酚物質(zhì)種類繁多，因此，抑制劑對(duì)其他主要酚類物質(zhì)酶促褐變的抑制作用，還有待于進(jìn)一步研究。

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