PPARα 激活對高脂飲食誘導的大鼠非酒精性脂肪性肝病的保護作用

李宗先，韓 真，汪再炎

皖南醫(yī)學院附屬弋磯山醫(yī)院消化內科，安徽 蕪湖241000

目前，國內外非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)被公認為是引起慢性肝臟疾病、肝功能異常最常見病因［1］。過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)屬于激素核受體超家族成員之一，主要包括PPARα、PPARβ、PPARγ 3 種亞型，PPARα 在肝臟細胞中高表達，具有調節(jié)膽汁酸代謝、脂肪酸攝取、活化，并影響細胞內脂肪酸結合及線粒體脂肪酸氧化［2-3］。近年來，越來越多的研究表明，PPARα 在脂肪肝的發(fā)病機制中有顯著作用。本研究中，我們主要探討PPARα 激動劑WY14643 對高脂飲食誘導的大鼠NAFLD 的保護作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選擇4 周齡SPF 級SD 雄性大鼠60 只。

1.2 主要試劑和儀器 WY14643(Sigma 公司)，PPARα 膽鹽輸出泵(Bsep)抗體(Santa Cruz 公司)。RT-PCR 試劑盒(大連寶生物公司)，實時熒光定量PCR 儀(ABI 7500)，全自動生化分析儀(Roche Modular DPP，瑞士)。

1.3 NAFLD 大鼠模型建立及分組 將大鼠喂養(yǎng)1周后隨機分為3 組，每組20 只，Ⅰ組以標準飼料喂養(yǎng)，Ⅱ組以高脂飼料喂養(yǎng)，Ⅲ組高脂飼料喂養(yǎng)，同時每日腹腔內注射WY14643 1 mg/kg，Ⅰ組和Ⅱ組每日腹腔內注射等量的生理鹽水。繼續(xù)喂養(yǎng)2 周后，處死全部大鼠。

1.4 標本采集 處死大鼠前禁食12 h，摘出肝臟切取相同部位肝組織，并用10%甲醛緩沖液固定，用于觀察肝臟病理變化，其余組織儲存于液氮中，用作提取總RNA 和蛋白。

1.5 測定血清生化指標 用全自動生化分析儀檢測3 組大鼠血清TBA、TG、TC、AST、ALT 變化。

1.6 大鼠肝臟病理切片 將分離出的大鼠肝臟組織，經HE 染色后，在倒置顯微鏡下觀察其病理學改變。

1.7 RT-PCR 檢測 按操作說明合成cDNA，引物設計PPARα (F:5＇-TAGCTATCCATTGTTGC-3＇，R:5＇-GCACTGAGTCGATCTCTTA-3＇)，Bsep (F:5＇-AGCGTAGCTTCCACCAAGC-3＇，R:5＇-GTACCGACTGACTCTAT-3＇)，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(F:5＇-ACTGTGTGTTATGAGGT-3＇，R:5＇-AATGAGTCCAGCTGACGT-3＇)。PCR 擴增條件，PPARα:95 ℃30 s，95 ℃5 s，58 ℃34 s;Bsep:95 ℃30 s，95 ℃5 s，56 ℃34 s。采用2-ΔΔCT值法計算目的基因相對表達量，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內參對照，Ⅰ組基因mRNA 相對表達量設為1，各組實驗獨立重復3 次，統(tǒng)計分析。

1.8 Western blotting 檢測 用裂解液提取肝臟組織總蛋白，調整3 組蛋白上樣量，使各組上樣量相等，在12%聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離，然后轉移至聚偏二氟乙烯膜，5%BSA 封閉1 h，分別用PPARα、Bsep 及GAPDH 的一抗與膜結合，4 ℃孵育過夜。TBST 洗膜后，分別與辣根過氧化物酶標記的二抗結合，室溫孵育1 h，經ECL 化學發(fā)光法顯色，Quantity One 軟件測灰度值，以PPARα、Bsep/GAPDH 吸光度比值表示。

1.9 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進行分析，多組均數(shù)間比較用單因素分析，2 組均數(shù)間比較用LSD 檢驗，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大鼠肝臟病理學變化 Ⅰ組大鼠肝臟肝小葉結構完整。Ⅱ組可見肝細胞不同程度的空泡變性、脂肪變性，Ⅲ組大鼠肝細胞變性壞死、脂肪變性及炎細胞浸潤與Ⅱ組比較均有所減輕(見圖1)。

圖1 大鼠肝臟病理改變(HE 200 ×) A:Ⅰ組;B:Ⅱ組;C:Ⅲ組Fig 1 Rat liver pathology (HE 200 ×) A:Ⅰgroup;B:Ⅱgroup;C:Ⅲgroup

2.2 大鼠血清生化指標變化 與Ⅰ組比較，Ⅱ組大鼠血清TBA、TG、TC、AST、ALT 明顯升高(P ＜0.01);與Ⅱ組比較，Ⅲ組大鼠血清TBA、TG、TC、AST、ALT 明顯降低(P ＜0.05，見表1)。

表1 大鼠血清生化指標(±s，n=3)Tab 1 Serum biochemical parameters of rats (±s)

表1 大鼠血清生化指標(±s，n=3)Tab 1 Serum biochemical parameters of rats (±s)

注:與Ⅰ組比較，aP ＜0.01;與Ⅱ組比較，bP ＜0.01，cP ＜0.05。

組別 AST(U/L) ALT(U/L) TBA(μmol/L) TG(mmol/L) TC(mmol/L)Ⅰ組 83.33 ±15.57 41.67 ±8.50 28.25 ±6.10 0.47 ±0.16 1.08 ±0.14Ⅱ組 151.00 ±21.52a 91.00 ±8.19a 82.06 ±18.23a 1.00 ±0.19a 2.43 ±0.60aⅢ組 103.00 ±15.52b 58.00 ±7.00c 51.48 ±14.49c 0.66 ±0.11c 1.54 ±0.31 c

2.3 大鼠肝臟組織PPARα、Bsep mRNA 表達 與Ⅰ組比較，Ⅱ組大鼠肝臟組織PPARα、Bsep mRNA 明顯降低(P ＜0.05);與Ⅱ組比較，Ⅲ組大鼠血清PPARα、Bsep mRNA 明顯升高(P ＜0.01，見圖2)。2.4 大鼠肝臟組織PPARα、Bsep 蛋白表達 與Ⅰ組比較，Ⅱ組大鼠肝臟組織PPARα、Bsep 蛋白明顯降低(P ＜0.05);與Ⅱ組比較，Ⅲ組大鼠血清PPARα、Bsep蛋白明顯升高(P ＜0.01，見圖3)。

圖2 大鼠肝臟組織PPARα、Bsep mRNA 表達Fig 2 Expressions of PPARα，Bsep mRNA in liver tissues of rats

圖3 Western blotting 分析PPARα、Bsep 蛋白表達Fig 3 Expressions of PPARα，Bsep protein by Western blotting analysis

3 討論

目前有關肝脂肪變性的病理生理機制尚不完全清楚，NAFLD 由于脂肪變性可進展為非酒精性脂肪性肝炎，進一步發(fā)展可發(fā)生脂肪性肝纖維化，最終導致肝硬化和肝癌［4］。由此可見，對于NAFLD 的早期干預及保護至關重要。

PPARα 屬于核轉錄因子，在肝臟細胞中可通過調控相關基因的表達，抑制炎癥因子的產生和釋放，減輕氧化應激反應對肝臟組織的損傷作用［5］。PPARα 激動劑可通過上調肝臟極低密度脂蛋白受體，降低甘油三酯，調節(jié)脂質代謝［6］。Fidaleo 等［7］研究發(fā)現(xiàn)，高脂飲食會增加小鼠肝臟脂肪儲存和氧化應激，PPARα 介導這一過程，高脂飲食可下調小鼠肝臟細胞PPARα 表達，且關閉PPARα 信號，從而降低β 氧化和過氧化氫酶活性。本實驗結果顯示，Ⅱ組的大鼠血清TBA、TG、TC、AST、ALT 等生化指標較Ⅰ組明顯升高，肝臟組織中PPARα 表達明顯下調，表明高脂飲食可下調PPARα 表達，與之前研究結果一致。PPARα 激動劑WY14643 經大鼠腹腔注射后，大鼠肝臟組織中PPARα表達明顯增高，同樣高脂飲食誘導大鼠NAFLD，結果發(fā)現(xiàn)Ⅲ組大鼠血清TBA、TG、TC、AST、ALT 等生化指標較Ⅱ組明顯降低，同時病理切片顯示，Ⅲ組大鼠肝細胞變性壞死、脂肪變性及炎性細胞浸潤較組Ⅱ明顯減輕，以上結果提示PPARα 激動劑WY14643 對高脂飲食誘導的大鼠NAFLD 具有保護作用。

PPARα 激動劑WY14643 對高脂飲食誘導的大鼠NAFLD 保護作用的潛在機制可能與Bsep 有關。Bsep是肝臟毛細膽管膜上膽汁酸外排的主要轉運體，Bsep功能異?？捎绊懩懼嵬馀耪系K，最終導致肝臟膽汁淤積［8］。肝臟脂肪變性與脂質代謝紊亂關系密切，Bsep 表達量會影響膽汁淤積，從而影響肝脂肪變性。本研究結果發(fā)現(xiàn)，當高脂飲食下調PPARα 表達時，Bsep 表達量同時降低，大鼠肝臟組織脂肪變性嚴重。當PPARα 激動劑WY14643 作用后，PPARα 表達量明顯升高，Bsep 表達量同時升高，此時，大鼠肝臟組織脂肪變性較單純高脂飲食誘導組明顯減輕。由此可見，WY14643 可通過激活PPARα 而上調Bsep 表達，進而起到對肝脂肪變性的保護作用。

綜上所述，PPARα 激活可保護高脂飲食誘導的大鼠NAFLD，其機制可能是PPARα 激活后上調Bsep 表達，減輕肝臟細胞膽汁淤積，但其具體信號通路有待進一步深入研究。

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