姜黃素治療肝纖維化與肝星狀細(xì)胞的關(guān)系

葉國榮，舒建昌，呂 霞，楊小紅

暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬廣州市紅十字會醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東 廣州510220

肝纖維化是肝臟受到各種慢性損傷后發(fā)生的一種 修復(fù)反應(yīng)，其特征是以膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)在肝內(nèi)過多沉積。目前國、內(nèi)外已有不少相關(guān)的報道表明姜黃素對肝纖維化具有治療作用［1-4］，本研究擬在我們既往研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步觀察姜黃素治療大鼠肝纖維化中活化肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSC)的數(shù)目、分布、凋亡等的變化，并探討兩者間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 主要藥物和試劑 姜黃素購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;丹參產(chǎn)于四川，為人工栽培，水煎配制為1.0 g/ml 灌胃液;四氯化碳(CCl4)購自天津市北宏試劑廠生產(chǎn);食用花生油;羧甲基纖維素鈉購自廣州器化醫(yī)療設(shè)備有限公司(進(jìn)口分裝);蘇木素、伊紅購自美國Sigma 公司;Masson 三色膠原試劑盒購自福建邁新有限公司。小鼠抗α-SMA 單克隆抗體、小鼠抗Desmin單克隆抗體及原位細(xì)胞凋亡檢測試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物和動物模型的建立

1.2.1 SD 大鼠:SPF 級，雄性，共80 只，體質(zhì)量180 ～230 g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供［動物質(zhì)量合格證號:SCXK (粵)2003-0001 粵監(jiān)證字2005A031］。于廣東省藥物研究所標(biāo)準(zhǔn)SPF 實(shí)驗(yàn)室(合格證號:粵監(jiān)證字2005C125 號)進(jìn)行動物飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 肝纖維化模型的建立:腹腔注射CCl40.025 ml(用花生油1∶6 稀釋)，3 次/周，共14 周。

1.3 動物分組及治療 動物隨機(jī)分為正常組(15只)、溶劑組(10 只)、姜黃素治療組(按給藥劑量的不同分為低、中、高劑量組，各10 只)、模型組(15 只)、丹參組(10 只)。正常組不予處理;溶劑組前8 周予腹腔注射花生油(每次0.15 ml/只)，3 次/周，第9 周起予0.5%羧甲基纖維素鈉灌胃，每次10 ml/kg，3 次/周，共6 周;姜黃素治療組從第9 周起予姜黃素(劑量分別為每100 g 體質(zhì)量10、20、40 mg)與0.5%羧甲基纖維素鈉混懸后以10 ml/kg 灌胃，3 次/周，共6 周;模型組則自第9 周起予0.5%羧甲基纖維素鈉灌胃，10 ml/kg，3次/周，共6 周;丹參組自第9 周起予丹參10 ml/kg 灌胃，3 次/周，共6 周。

1.4 觀察項(xiàng)目 于第8 周末處死正常組及模型組各5 只大鼠，進(jìn)行血清及病理檢測觀察造模效果。14 周動物實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，留取部分肝組織于10 g/L 中性甲醛液固定。

肝組織按常規(guī)方法行HE 染色，參照試劑盒方法行Masson 三色膠原染色，光鏡下觀察肝臟的病理改變，并按照肝纖維化半定量計(jì)分系統(tǒng)(SSS)方法，對各組大鼠肝纖維化程度評分，得分越高，表示纖維化程度越重;最高29 分，最低0 分［1］。SABC 免疫組化法檢測肝組織α-SMA。采用專業(yè)顯微圖像分析軟件(Axio-Vision，4.5 版，Germany)進(jìn)行圖像分析。

HSC 凋亡檢測及鑒定:參照試劑盒說明書進(jìn)行TUNEL 染色后，繼續(xù)將切片于0.01 mol/L 檸檬酸緩沖液中微波煮沸修復(fù)10 min，常溫冷卻，蒸餾水洗2 min ×3次，加正常山羊血清室溫封閉20 min，甩去多余液體，直接加小鼠抗Desmin 單克隆抗體(稀釋度1 ∶100)50 μl，以PBS 代替一抗作為陰性對照，4 ℃冰箱過夜，同上洗滌，滴加生物素化山羊抗小鼠IgG 于37 ℃溫箱中孵育20 min，同上洗滌，滴加SABC 試劑室溫孵育20 min，PBS 洗4 次，每次5 min，新鮮配置的DAB 顯色，顯微鏡下控制反應(yīng)時間，終止反應(yīng)，蒸餾水洗，核固紅復(fù)染30 min，蒸餾水洗后，水溶性封片劑封片。顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)HSC 凋亡數(shù)目，計(jì)算凋亡指數(shù):(每100 個細(xì)胞中凋亡細(xì)胞的數(shù)目÷100)×100%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 12.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)用±s 表示，多組數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，若各組總體方差齊，采用Tukey(n ＞5)檢驗(yàn);若各組總體方差不齊，采用Tamhane’S T2 檢驗(yàn)。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 造模效果 實(shí)驗(yàn)過程中，80 只SD 大鼠有3 只死亡，死亡率3. 75%，其中低姜黃素組1 只，模型組2只。比較第8 周末處死的正常組及模型組大鼠，模型組大鼠肝臟大體觀色澤偏暗，表面欠光滑，體積未見明顯變化，肝臟邊緣變純，質(zhì)地較實(shí)，有結(jié)節(jié)感;血清ALT、AST、HA、LN、PC-Ⅲ明顯升高;病理切片觀察有較多纖維生成，證實(shí)肝纖維化形成，造模成功。

2.2 肝組織病理 HE 染色見正常組與溶劑組肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝索排列整齊，無變性、壞死，無炎癥細(xì)胞浸潤;模型組肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞，肝索排列紊亂，有炎癥細(xì)胞浸潤，肝細(xì)胞水腫、脂肪變性明顯，部分可見假小葉形成;高姜黃素治療組及丹參組可見匯管區(qū)有少量的纖維組織增生，未見假小葉形成，有少量炎癥細(xì)胞浸潤，肝細(xì)胞水腫、脂肪變性明顯減輕;低姜黃素治療組與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05);中姜黃素治療組情況介于低、高姜黃素治療組之間(見圖1)。

Masson 膠原染色:正常組與溶劑組肝組織結(jié)構(gòu)完整，僅在匯管區(qū)有極少量膠原纖維存在，肝小葉間未見纖維組織增生，無假小葉形成;模型組見匯管區(qū)大量膠原纖維增生，增生的膠原纖維形成纖維分隔，破壞肝小葉結(jié)構(gòu)，分割、包繞肝小葉，有假小葉形成;高姜黃素治療組及丹參組膠原纖維明顯減少，只見匯管區(qū)有較多的纖維組織增生，少部分見膠原向周邊延伸，無假小葉存在;低姜黃素治療組與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05);中姜黃素冶療組情況介于低、高姜黃素治療組之間(見圖2)。

按照肝纖維化半定量評分方法，單盲讀片并予以評分。結(jié)果顯示:正常組、溶劑組得分比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05);與正常組、溶劑組比較，模型組肝纖維化評分明顯升高(P =0.000);低姜黃素治療組得分與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05);中姜黃素治療組、高姜黃素治療組、丹參組得分呈不同程度降低，與模型組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01，見表1)。

2.3 α-SMA 免疫組織化學(xué)染色 陰性對照片背景潔

凈，無非特異性染色，陽性對照片可見陽性表達(dá)。正常組、溶劑組血管壁可見少量α-SMA 陽性表達(dá)，膽管壁不表達(dá);模型組α-SMA 陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)明顯增多，主要分布于門靜脈、匯管區(qū)血管壁、纖維間隔、少量表達(dá)于鄰近的肝實(shí)質(zhì)竇周間隙、偶見于中央靜脈壁，呈長橢圓形或梭形;低姜黃素治療組、中姜黃素治療組、高姜黃素治療組α-SMA 陽性表達(dá)量逐漸減少，可見于血管壁，匯管區(qū);丹參組陽性表達(dá)與高姜組類似(見圖3)。各組圖像分析結(jié)果見表1。結(jié)果顯示:比較正常組、溶劑組兩組，陽性染色所占面積比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05);與正常組、溶劑組比較，模型組陽性部分所占面積比例明顯升高(P =0.000);低姜黃素治療組的陽性表達(dá)面積與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05);中姜黃素治療組、高姜黃素治療組的陽性表達(dá)面積比例均有所降低，隨著姜黃素劑量的增加，降低幅度增大，與模型組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05);丹參組與高姜黃素治療組類似，陽性表達(dá)的減少差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。

2.4 HSC 凋亡檢測及鑒定 觀察凋亡細(xì)胞的位置、形態(tài)、大小等，結(jié)合Desmin 陽性表達(dá)分布情況，鑒定凋亡細(xì)胞是否為HSC，觀察結(jié)果如下:正常組、溶劑組細(xì)胞凋亡數(shù)量極少，在一張切片偶可見1 ～2 個凋亡細(xì)胞;模型組細(xì)胞凋亡數(shù)量少;模型組細(xì)胞凋亡數(shù)量少，胞核呈紫藍(lán)色(箭頭所示);高姜黃素治療組、丹參組可見較多凋亡細(xì)胞，可見雙染陽性者，細(xì)胞胞核呈紫藍(lán)色，細(xì)胞漿呈棕黃色(箭頭所示)，多分散于竇周;低姜黃素治療組可見凋亡細(xì)胞，但數(shù)目明顯較高姜組、丹參組少(見圖4)。

圖1 肝組織切片HE 染色(200 ×) A:正常組;B:模型組;C:高姜黃素組;圖2 肝組織切片Masson 染色(100 ×) A:正常組;B:模型組;C:高姜黃素組;圖3 α-SMA 免疫組化染色結(jié)果(200 ×) A:正常組;B:模型組;C:高姜黃素組;圖4 TUNEL 法結(jié)合Desmin 免疫組化雙染色檢測HSC 凋亡結(jié)果(400 ×) A:正常組;B:模型組;C:高姜黃素組Fig 1 HE staining for livers (200 ×) A:normal group;B:model group;C:high dose curcumin group;Fig 2 Masson staining for livers (100 ×) A:normal group;B:model group;C:high dose curcumin group;Fig 3 α-SMA immuohistochemistry staining for livers (200 ×) A:normal group;B:model group;C:high dose curcumin group;Fig 4 Double-stain of terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)dUTP nickend labeling (TUNEL)and Desmin immuohistochemistry staining to detect HSC apoptosis (400 ×)A:normal group;B:model group;C:high dose curcumin group

凋亡指數(shù)見表1，結(jié)果顯示:正常組、溶劑組凋亡率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05);姜黃素治療組中，低姜黃素治療組與模型組比較，凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05);中姜黃素治療組、高姜黃素治療組與模型組比較，凋亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，且隨著姜黃素劑量的增加而增加，說明姜黃素可以誘導(dǎo)HSC 凋亡;丹參組與高姜黃素治療組類似，可增加凋亡率，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。

表1 各組病理檢查結(jié)果比較(±s)Tab 1 Comparison of pathologic examination results of each group (±s)

表1 各組病理檢查結(jié)果比較(±s)Tab 1 Comparison of pathologic examination results of each group (±s)

注:與模型組比較，* P ＜0.05，※P ＜0.01。

組別 SSS 得分 α-SMA 凋亡指數(shù)正常組 0.150 ±0.242※ 0.960 ±0.280※ 0.160 ±0.127※溶劑組 0.100 ±0.316※ 0.899 ±0.306※ 0.120 ±0.140※低姜組 18.722 ±7.488 7.109 ±1.061 0.822 ±0.393中姜組 13.600 ±5.353※ 6.387 ±1.084※ 1.240 ±0.548*高姜組 9.850 ±3.749※ 3.710 ±0.632※ 1.700 ±0.682※模型組 22.313 ±6.676 8.614 ±1.801 0.600 ±0.370丹參組 7.250 ±3.676※ 2.865 ±0.591※ 1.920 ±0.444※

3 討論

HSC 在各種刺激因子的作用下大量地活化、增殖，是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。許多研究表明，抑制HSC 活化、增殖是抗纖維化治療的一個有效途徑。抑制HSC 活化、增殖，可以從細(xì)胞因子及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑進(jìn)行調(diào)控，也可以通過清除肝細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞損傷壞死時釋放的氧化刺激因子，如氧自由基與炎性細(xì)胞因子等環(huán)節(jié)來進(jìn)行。

姜黃素具有抑制、減少相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)的作用，干擾其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而抑制HSC 活化、增殖［5］。Kang等［6］在細(xì)胞及活體水平均發(fā)現(xiàn)姜黃素可以抑制膠原合成及HSC 活化。PPAR-γ 表達(dá)于正常鼠肝臟的HSC，伴隨著肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展，PPAR-γ 水平顯著降低。Zheng 等［7-8］研究表明，在細(xì)胞水平，姜黃素可通過誘導(dǎo)PPAR-γ 基因表達(dá)，抑制TGF-β 受體基因的表達(dá)，阻斷TGF-β 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而抑制HSC 的活化、增殖。姜黃素是一種抗氧化劑，它能清除肝纖維化發(fā)生、發(fā)展過程中各種細(xì)胞損傷后釋放的有關(guān)氧化刺激因子，升高相關(guān)的酶類(如SOD)而發(fā)揮抑制HSC 活化的作用。

我們的前期研究工作證實(shí):在細(xì)胞水平，姜黃素能顯著抑制體外培養(yǎng)的大鼠HSC 增殖，使細(xì)胞周期停滯于G2/M 期，并誘導(dǎo)其凋亡，其作用具有明確的時間、劑量相關(guān)性，其作用機(jī)制與姜黃素可使促凋亡基因Fas、P53 表達(dá)增加，抑制凋亡基因Bcl-2 表達(dá)減少有關(guān)［9-12］;在大鼠活體水平，姜黃素可通過抑制HSC 活化和增殖、誘導(dǎo)HSC 凋亡而發(fā)揮預(yù)防肝纖維化的作用［13］。本實(shí)驗(yàn)通過采用免疫組化方法，結(jié)合圖像分析，觀察肝組織中α-SMA 等判斷HSC 活化情況。結(jié)果表明，模型組活化的HSC 明顯增多;經(jīng)姜黃素治療后，活化的HSC 明顯減少。提示抑制HSC 活化、增殖，可能是姜黃素治療肝纖維化的另一作用機(jī)制。

關(guān)于姜黃素誘導(dǎo)HSC 凋亡的作用，近年來已成為研究的熱點(diǎn)。在肝纖維化的逆轉(zhuǎn)過程中，伴隨有HSC的凋亡。在嚙齒類動物的實(shí)驗(yàn)證明，增加HSC 的凋亡可促進(jìn)肝纖維化的消退，因此，國內(nèi)外學(xué)者在調(diào)節(jié)HSC 凋亡的決定性分子事件，尋找刺激HSC 凋亡的靶向性藥物等方面進(jìn)行了大量的研究。Zheng 等［14］研究表明通過誘導(dǎo)PPAR-γ 基因表達(dá)，可促進(jìn)HSC 的凋亡。我們曾用不同濃度的姜黃素處理HSC 株HSCT6，以流式細(xì)胞儀、透射電鏡和瓊脂糖電泳法檢測HSC 凋亡，結(jié)果姜黃素處理組凋亡指數(shù)明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;行免疫組化檢測相關(guān)基因蛋白表達(dá)，提示姜黃素通過增加促凋亡基因Fas、P53 表達(dá)、減少抑制凋亡基因Bcl-2 表達(dá)而起到誘導(dǎo)HSC 凋亡的作用［9-12］;而在大鼠活體水平，觀察到姜黃素具有誘導(dǎo)HSC 凋亡的作用，我們認(rèn)為這是姜黃素預(yù)防肝纖維化的重要作用機(jī)制之一［13］。

本實(shí)驗(yàn)中，我們用經(jīng)典的TUNEL 凋亡檢測方法，與Desmin 免疫組化染色結(jié)合的方法檢測并鑒定肝組織中HSC 的凋亡，起到了定性的作用，實(shí)驗(yàn)操作簡便、結(jié)果真實(shí)可靠。結(jié)果提示，在模型組，HSC 凋亡極少發(fā)生，而在姜黃素的治療下，凋亡HSC 的數(shù)目明顯增多，凋亡率隨著姜黃素劑量的增加而增加，表明姜黃素具有促進(jìn)HSC 凋亡的作用，這可能也是姜黃素治療肝纖維化的重要作用機(jī)制之一。

關(guān)于姜黃素在發(fā)揮治療肝纖維化作用時，其誘導(dǎo)HSC 凋亡的相關(guān)分子機(jī)制等仍有待進(jìn)一步研究?？山梃b姜黃素在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡方面的工作成果，采用分子生物學(xué)、免疫學(xué)、形態(tài)學(xué)及其他方面的相關(guān)理論和技術(shù)進(jìn)行深入研究。

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