小干擾RNA 沉默IKK/NF-κB 信號通路對HSC-T6 細胞增殖的影響

張彥亮，吳會玲，宋 爽，岳巧艷，申玉英，陶 臻

南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院感染科，江蘇 南京210006

肝纖維化是各種慢性肝病所共有的病理特征過程，雖病因不同，但其共同途徑均是肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)的激活和增殖［1］，如能抑制肝纖維化效應(yīng)細胞HSC 的增殖，則可阻滯肝臟的纖維化進程，甚至實現(xiàn)其病理過程的逆轉(zhuǎn)。多個研究顯示核因子κB(nucler factor-kappaB，NF-κB)在激活的HSC中活性明顯增強［2-3］，本研究采用siRNA 干擾技術(shù)，沉默肝星狀細胞株HSC-T6 IKK/NF-κB 信號通路，研究其對HSC 活化增殖的影響，為實現(xiàn)肝纖維化逆轉(zhuǎn)治療提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞 大鼠肝星狀細胞株HSC-T6 購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.2 主要試劑及器材 脂質(zhì)體Lipofectamine 2000、TRIzol 購自美國Invitrogen 公司;RPMI-164 購自美國Gibco 公司;DMSO(溶解Formazan 結(jié)晶)購自中國上海久億化學(xué)試劑有限公司、cDNA 第一鏈合成試劑盒及Taq DNA Polymerase 均購自美國Thermo Fisher 公司;Penicillin/streptomycin solution、0.25% Tripsin-EDTA、PBS 均購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng):將液氮中的凍存管取出緩慢溶解，接著進行細胞復(fù)蘇和細胞傳代，使細胞密度達1×106～1 ×107個/ml;按每管1 ～1.5 ml 的量分裝于凍存管內(nèi)，擰緊管蓋，在凍存管上做好標(biāo)記，包括細胞代號及凍存日期，進行逐步降溫將細胞凍存。

1.3.2 設(shè)計、構(gòu)建、合成siRNA:通過NCBI 的Gen-Bank 數(shù)據(jù)庫搜索IKKβ 的cDNA 序列，按照siRNA 設(shè)計原則設(shè)計IKKβ siRNA，RT-PCR 檢測siRNA 表達對IKKβ 的基因表達(RNA 由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成，引物由南京金斯瑞科技有限公司合成)。siRNA-1014:S 5＇-CCCUCGAUGACAUCUUGAAUU-3＇;AS 3＇-UUGGGAGCUACUGUAGAACUU-5＇。

1.3.3 轉(zhuǎn)染siRNA:轉(zhuǎn)染接種適當(dāng)數(shù)量的細胞至細胞培養(yǎng)板中，每孔加入不含抗生素的培養(yǎng)基，使轉(zhuǎn)染時的細胞密度能夠達到50% ～60%;用250 μl 不含血清培養(yǎng)基Opti-MEM 稀釋20 μmol/L 的貯存液輕輕混勻，室溫孵育5 min;用250 μl 不含血清培養(yǎng)基Opti-MEM 稀釋5 μl lipo2000，輕輕混勻并室溫孵育5 min;將兩者輕輕混勻，室溫孵育20 min;將siRNA-lipo2000 混合液加入含有細胞的500 μl 培養(yǎng)基的培養(yǎng)孔中，輕輕混勻培養(yǎng)4 ～6 h 后，將孔中含siRNA-lipo2000 混合液的培養(yǎng)基移去，更換新鮮培養(yǎng)基置于37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.4 MTT 法檢測細胞增殖:將細胞消化、計數(shù)，配制成濃度為5 ×104個/ml 的細胞懸液，96 孔細胞培養(yǎng)板中每孔加入100 μl 細胞懸液，空白對照組、陰性對照組及實驗組均設(shè)6 個復(fù)孔，siRNA 轉(zhuǎn)染，將培養(yǎng)板置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48、72 h 后，進行MTT 染色，λ =490 nm，測定OD 值，計算各組抑制率:抑制率(%)= (對照組- 實驗組)/對照組×100%。

1.3.5 流式細胞儀檢測細胞周期:將對數(shù)生長期的細胞消化接種到6 孔板中，次日待細胞貼壁后，根據(jù)組別設(shè)置加入相應(yīng)的含藥培養(yǎng)基，同時設(shè)立陰性對照組。siRNA 轉(zhuǎn)染作用24、48、72 h 后，用0.25%的胰酶(不含EDTA)消化并洗滌離心后收集5 ×105個細胞;再將制備好的單細胞懸液用體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇固定2 h，4 ℃保存，染色前用PBS 洗去固定液加100 μl RNase A 37 ℃水浴30 min，再加入400 μl PI 染色混勻，4 ℃避光30 min 后上BD 流式細胞儀測試，記錄激發(fā)波長488 nm 處紅色熒光。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 19.0 軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料用±s 表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t 檢驗。P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細胞形態(tài)學(xué)改變 倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)，空白對照組和陰性對照組HSC-T6 細胞呈梭形，生長良好，IKKβ siRNA 作用48 h 后實驗組細胞增殖受到抑制，細胞生長緩慢，單位視野細胞數(shù)較空白對照組、陰性對照組減少，細胞形態(tài)呈球形、橢圓形改變，胞核有濃聚表現(xiàn)。

2.2 MTT 檢測細胞增殖 三組在24 h 時細胞增殖情況比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F =0.95，P ＞0.05);而在48 h 時實驗組HSC-T6 細胞增殖受到明顯抑制，抑制率達24%，較空白對照及陰性對照組明顯降低(F =8.95，P ＜0. 05);72 h 時實驗組細胞增殖抑制率達44%，抑制效應(yīng)更為明顯(F=18.75，P ＜0.01，見表1)。

表1 MTT 檢測細胞增殖Tab 1 Cell proliferation detected by MTT

2.3 流式細胞儀檢測HSC-T6 細胞周期 IKKβ siRNA 干預(yù)24、48、72 h 后實驗組G0/G1期的細胞百分比顯著升高，與空白對照組和陰性對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=9.45，P ＜0.05);實驗組72 h 組G0/G1期的細胞百分比顯著高于48 h 和24 h 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=12.76，P ＜0.05，見圖1、表2)。

3 討論

肝纖維化是各種慢性肝病向肝硬化發(fā)展的必經(jīng)階段，研究表明不同病因肝纖維化發(fā)生最終共同途徑是HSC 的激活［4］。激活的HSC 大量增殖合成過多的膠原和細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)，導(dǎo)致肝內(nèi)ECM 過量積聚，膠原沉積，最終導(dǎo)致肝纖維化和肝硬化形成。HSC 不僅是肝臟炎癥過程的靶細胞，更是炎癥的效應(yīng)細胞，因此針對HSC 來防治肝纖維化已成為肝病領(lǐng)域新的研究熱點。

NF-κB 是轉(zhuǎn)錄因子家族的重要成員，參與多種炎癥性細胞因子、趨化因子和促纖維形成細胞因子的合成、細胞增殖、細胞外間質(zhì)交聯(lián)、細胞凋亡及成纖維細胞的分化過程［5］。而在肝病領(lǐng)域的研究顯示NF-κB在激活的HSC 中活性明顯增強，與HSC 的激活增殖密切相關(guān)。NF-κB 作為炎癥反應(yīng)最為重要的轉(zhuǎn)錄因子，能夠調(diào)控枯否細胞分泌多種細胞因子及促炎介質(zhì)，放大肝臟炎癥損傷反應(yīng)，從而促進HSC 的激活增殖［6］。

圖1 PI 單染法檢測細胞周期Fig 1 Cell cycle performed by PI single staining method

表2 流式細胞儀檢測細胞周期(±s，%)Tab 2 Cell cycle performed by flow cytometry (±s，%)

表2 流式細胞儀檢測細胞周期(±s，%)Tab 2 Cell cycle performed by flow cytometry (±s，%)

注:G0 =靜止期細胞的百分?jǐn)?shù);G1 =DNA 合成前期細胞的百分?jǐn)?shù);G0/G1 =停留于G0/G1 期(無增殖活動期)細胞的百分?jǐn)?shù);S=DNA 合成期細胞的百分?jǐn)?shù);M =DNA 分裂細胞的百分?jǐn)?shù);G2 =DNA 合成后期細胞的百分?jǐn)?shù)。與實驗組相比，* P ＜0.05;與72 h 組相比，#P ＜0.05。

分組 G0/G1 S G 2空白對照組24 h 49.10 ±0.265* 43.27 ±0.127 7.70 ±0.078 48 h 50.45 ±0.075* 41.65 ±0.095 7.76 ±0.132 72 h 51.06 ±0.074* 43.40 ±0.080 5.43 ±0.046陰性對照組24 h 50.33 ±0.043* 41.35 ±0.049 8.28 ±0.035 48 h 51.44 ±0.053* 43.10 ±0.046 5.45 ±0.035 72 h 52.04 ±0.067* 41.80 ±0.125 6.17 ±0.092實驗組24 h 54.72 ±0.112# 40.49 ±0.046 4.69 ±0.045 48 h 59.59 ±0.122# 36.72 ±0.051 3.73 ±0.045 72 h 72.46 ±0.080 23.52 ±0.035 4.04 ±0.127

在經(jīng)典的IKK/NF-κB 信號通路中，蛋白激酶IKK復(fù)合體(IκB 激酶)是NF-κB 信號通路的主要調(diào)節(jié)物［7］。它由三個亞基組成:催化亞基IKKα、IKKβ 和調(diào)節(jié)亞基IKKγ，其中IKKβ 在經(jīng)典的NF-κB 信號通路活化過程中發(fā)揮尤為重要的作用。將鼠的IKKβ 基因敲除后，胚胎時期就會死亡，并會由于肝細胞發(fā)生凋亡而表現(xiàn)出肝臟退化病變，這與p65 基因敲除鼠的表型很相近，而且在外界因子(如TNF)的刺激下，IKKβ 基因敲除鼠的NF-κB 活化受到嚴(yán)重抑制，可見IKKβ 是NF-κB 活化所必需的亞基。

本研究通過設(shè)計構(gòu)建合成siRNA 抑制HSC-T6 細胞中IKKβ 基因表達，使得與NF-κB 緊密結(jié)合的抑制蛋白IκB 無法磷酸化，從而沉默IKK/NF-κB 信號通路，觀察HSC-T6 細胞增殖情況，結(jié)果顯示實驗組細胞培養(yǎng)48、72 h 后，細胞增殖明顯受到抑制，細胞形態(tài)呈球形及橢圓形改變、胞核濃聚等表現(xiàn)。MTT 法顯示與空白對照組和陰性對照組相比，實驗組細胞增殖明顯受到抑制，且隨著IKKβ siRNA 作用時間的延長，增殖抑制效應(yīng)更為明顯，結(jié)果進一步證實了IKK/NF-κB 信號通路參與了HSC 激活增殖的過程，是肝纖維化發(fā)生至關(guān)重要的信號通路之一，通過干擾沉默此信號通路能顯著抑制HSC 的活化和增殖。

同時我們還研究了HSC-T6 細胞周期的變化，結(jié)果顯示沉默IKK/NF-κB 信號通路后，G0/G1期細胞數(shù)量的百分比顯著升高，與空白對照組和陰性對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，同時IKKβ siRNA 作用72 h組，G0/G1期的細胞百分比最高，與24 h 和48 h 組相比，也存在顯著性差異。以往的研究［8］顯示細胞周期有2 個突發(fā)性的轉(zhuǎn)折點:G1-S 及G2-M，當(dāng)G0/G1期細胞數(shù)量增多，S 期與G2/M 期細胞數(shù)量減少意味著細胞增殖周期受到阻滯，細胞有絲分裂水平降低。因此我們認為siRNA 沉默IKK/NF-κB 信號通路對于細胞周期的G1-S 重要轉(zhuǎn)折點具有調(diào)控作用是其抑制HSC細胞活化增殖的關(guān)鍵所在。

總之，肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展是一個極其復(fù)雜的過程，HSC 在肝纖維化的病理過程中扮演著最為重要的角色，是肝纖維化形成的細胞學(xué)基礎(chǔ)。本研究結(jié)果表明，利用siRNA 沉默IKK/NF-κB 信號通路對HSC 增殖具有明顯的抑制作用，為今后臨床肝纖維化基因治療提供了新的方法。

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