奧沙利鉑聯(lián)合替尼泊苷對(duì)胃癌HGC 細(xì)胞上Livin 蛋白影響的實(shí)驗(yàn)研究

張 鵬，潘 穎，高 悅

1.北京市石景山醫(yī)院藥劑科，北京100049;2.河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院藥劑科

胃癌是目前較為常見的腫瘤，具有發(fā)病率高、惡性程度高的特點(diǎn)。由于早期診斷較為困難，發(fā)現(xiàn)時(shí)多為晚期，失去手術(shù)機(jī)會(huì)，所以化療成為主要治療手段。目前研究表明［1］，奧沙利鉑(Oxaliplatin，OXA)對(duì)胃癌具有較好療效。廣泛用于小細(xì)胞肺癌的替尼泊苷［2］(Teniposide，VM26)，對(duì)控制胃癌的發(fā)生、發(fā)展也有一定效果。Livin 蛋白［3-4］是近年來發(fā)現(xiàn)的癌癥抑制因子，該蛋白可作為胃癌分子標(biāo)志物之一，在胃癌組織中表達(dá)量增高，如在胃癌發(fā)展過程中表達(dá)減少，則可說明癌細(xì)胞得到控制［5］。本實(shí)驗(yàn)采用較為常見的胃癌HGC 細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察兩種化療藥物使用后對(duì)Livin 蛋白表達(dá)的影響，旨在為臨床化療方案的選擇提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)并探究相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑 胃癌HGC 細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院中心細(xì)胞庫(北京)，PMI 1640 培養(yǎng)基購(gòu)自北京鼎國(guó)(CC0031);胎牛血清購(gòu)自 Hyclone(SH30084.03);Anti-Livin 購(gòu)自Abcam;DAB 顯色試劑盒購(gòu)自北京鼎國(guó)(AR1022);RIPA 裂解液購(gòu)自北京鼎國(guó)(WB0071)。凝膠成像分析儀及電轉(zhuǎn)儀購(gòu)自Bio-Rad;PCR 儀購(gòu)自ABI(9700)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組處理:細(xì)胞用10%胎牛血清培養(yǎng)，接種密度為5 ×105/ml，于25 ml 培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。放置在含5% CO2，37 ℃飽和濕度的培養(yǎng)箱中保存，胰蛋白酶消化，傳代，實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞均處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期?？瞻讓?duì)照組用10% 胎牛血清培養(yǎng)，不用藥培育48 h;OXA 組在空白對(duì)照組基礎(chǔ)上，予濃度為1.25 g/ml OXA 0.5 ml 培育48 h;VM26 組在空白對(duì)照組基礎(chǔ)上，予濃度為1.25 g/ml VM26 0.5 ml 培育48 h;聯(lián)合組在空白對(duì)照組基礎(chǔ)上，予濃度為1.25 g/ml OXA 0.25 ml 及濃度為1.25 g/ml VM26 0.25 ml 培育48 h;取細(xì)胞備用。

1.2.2 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)蛋白表達(dá):細(xì)胞用藥48 h后，用5%多聚甲醛固定30 min，滴加5%山羊血清封閉液，室溫20 min。滴加稀釋倍數(shù)為1∶250 的兔抗鼠Livin 抗體，4 ℃過夜。PBS 洗2 min ×3 次。滴加生物素化山羊抗兔IgG，37 ℃20 min。PBS 洗2 min ×3次。滴加試劑SABC，37 ℃20 min。PBS 洗5 min ×4次。使用DAB 顯色試劑盒顯色，按試劑盒說明操作后，蒸餾水洗滌，蘇木素輕度復(fù)染，封片，顯微鏡下觀察，拍照。用Image-pro plus 5.0 分析計(jì)算光密度值。1.2.3 RT-PCR 檢測(cè)基因表達(dá):按照試劑盒說明書采用Trizol 一步法，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。Livin引物序列:上游引物5＇-TCCACAGTGTGCAGGAGACT-3＇，下游引物5＇-ACGGCACAAAGACGATGGAC-3＇;內(nèi)參序列:上游引物5＇-AGCGCAAGTACTCCGTGTG-3＇，下游引物5＇-AAGCAATGCTATCACCTCCC-3＇;25 μl 反應(yīng)體系，預(yù)變性94 ℃1 min，退火60 ℃1 min，延伸72 ℃2 min，循環(huán)35 次。余按試劑盒說明進(jìn)行操作，用反應(yīng)產(chǎn)物的吸光度與內(nèi)參的比值表示該基因表達(dá)強(qiáng)度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 10.3 軟件進(jìn)行2 ×2 析因設(shè)計(jì)方差分析，計(jì)量資料用±s 表示，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)蛋白表達(dá) 免疫組化圖片顯示，Livin 蛋白多表達(dá)在胞漿中，結(jié)果顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05，見圖1 ～2)。與空白對(duì)照組相比，OXA 組、VM26 組及聯(lián)合組腫瘤組織內(nèi)Livin 蛋白表達(dá)減少(P ＜0.05)，且兩種藥物作用效果具有交互作用(P ＜0.05)。

圖1 不同組中Livin 蛋白陽性表達(dá)情況(200 ×) A:空白對(duì)照組;B:OXA 組;C:VM26 組;D:聯(lián)合組Fig 1 Livin positive product in each group (200 ×) A:blank control group;B:OXA group;C:VM26 group;D:OXA combined with VM26 group

圖2 不同組中Livin 蛋白表達(dá)光密度值Fig 2 Optical density value of Livin positive product

2.2 RT-PCR 檢測(cè)基因表達(dá) 采用RT-PCR 方法檢測(cè)Livin mRNA 表達(dá)，統(tǒng)計(jì)學(xué)交互性分析結(jié)果顯示，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0. 05)。與空白對(duì)照組相比，OXA 組、VM26 組及聯(lián)合組腫瘤組織內(nèi)Livin mRNA 表達(dá)減少(P ＜0.05)，且兩種藥物作用效果具有交互作用(P ＜0.05，見圖3)。

圖3 不同組中Livin mRNA 相對(duì)表達(dá)量Fig 3 The relative expression of Livin mRNA

3 討論

胃癌是一種常見病、多發(fā)病，嚴(yán)重危害人類健康，影響生活質(zhì)量。有研究［6-8］表明，胃癌的發(fā)生是多層次、有序化過程，引起正常胃黏膜導(dǎo)致癌變的機(jī)制，可能與抑癌基因表達(dá)減弱、癌基因表達(dá)增強(qiáng)有關(guān)。Livin蛋白［9-10］是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein，IAP)家族的成員，與胃癌、肝癌、肺癌等多種腫瘤發(fā)生密切相關(guān)，成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)，引起廣泛重視。該蛋白［11-12］通過同Caspases 結(jié)合，抑制Caspases活性，阻斷凋亡途徑，引起凋亡障礙，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。Tu［13］研究表明，Livin 基因表達(dá)同胃癌患者的預(yù)后及生存率存在相關(guān)性。Wang 等［14］通過試驗(yàn)證實(shí)，Livin 蛋白表達(dá)減少的腫瘤患者預(yù)后較好，生存期較蛋白表達(dá)變化不大的患者長(zhǎng)。Zhao 等［15］通過基因沉默技術(shù)發(fā)現(xiàn)Livin 基因同腫瘤惡性程度具有相關(guān)性。

本實(shí)驗(yàn)采用較為常見的胃癌HGC 細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察兩種化療藥物使用后對(duì)Livin 蛋白及基因表達(dá)的影響，旨在為臨床化療方案的選擇提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)并探究相關(guān)機(jī)制。研究結(jié)果顯示，在蛋白層面上，同空白對(duì)照組相比，OXA 組、VM26 組及聯(lián)合組腫瘤組織內(nèi)Livin 蛋白表達(dá)減少，說明OXA 和VM26 這兩種因素都可以抑制Livin 蛋白的表達(dá)，且2 種因素之間存在交互作用，在基因?qū)用嫔?，RT-PCR 結(jié)果顯示與蛋白結(jié)論吻合，說明該蛋白表達(dá)減少可能是通過下調(diào)mRNA 實(shí)現(xiàn)的，且OXA 和VM26 都可以下調(diào)Livin 基因表達(dá)，且兩種因素之間存在交互作用。本研究結(jié)論，同馬望等［16］的研究結(jié)論具有一致性，為研究OXA 和VM26治療胃癌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步增加體內(nèi)試驗(yàn)研究。

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