胃癌組織中DPC4 和PTEN 蛋白表達(dá)特點(diǎn)及臨床意義

曾 偉，戴益琛

解放軍174 醫(yī)院消化內(nèi)科，福建 廈門361003

胃癌的發(fā)生、發(fā)展是個(gè)多階段過程，與多種癌基因激活和抑癌基因失活有關(guān)。近年有文獻(xiàn)報(bào)道一些抑癌基因的表達(dá)缺失與胃癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、臨床病理特征及預(yù)后關(guān)系密切［1-2］。其中DPC4 及PTEN 基因備受關(guān)注。位于染色體18q21.1 的DPC4 基因編碼的蛋白在多種腫瘤中發(fā)揮抑制癌細(xì)胞作用，但在胃癌中研究報(bào)道甚少［3］。PTEN 基因是目前發(fā)現(xiàn)的第1 個(gè)具有雙特異磷酸酶活性的抑癌基因，其編碼的蛋白在細(xì)胞生長(zhǎng)、黏附、遷移、浸潤(rùn)及凋亡等方面具有重要作用［2］。同時(shí)PTEN 與DPC4 之間關(guān)系目前尚未明確。針對(duì)上述問題，我們采用免疫組化的方法對(duì)胃癌組織中DPC4、PTEN 蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，旨在探討兩者在胃癌發(fā)生、發(fā)展中扮演的角色。

1 資料與方法

1.1 一般資料 隨機(jī)選取解放軍174 醫(yī)院2013 年5月-2014 年8 月手術(shù)切除并經(jīng)病理檢查證實(shí)的胃癌患者60 例，所有患者術(shù)前均未行放療、化療、生物治療等腫瘤針對(duì)性治療。男32 例，女28 例;年齡29 ～71歲，平均年齡(59.1 ±2.5)歲;淋巴結(jié)陽(yáng)性者26 例、淋巴結(jié)陰性者34 例;臨床分期:Ⅰ期16 例、Ⅱ期16 例、Ⅲ期4 例、Ⅳ期24 例。對(duì)照組:隨機(jī)選取30 例癌旁5 cm 以外的正常胃黏膜標(biāo)本。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 鼠抗人DPC4 免疫組化單克隆抗體，鼠抗人PTEN 免疫組化單克隆抗體;制片使用LEICA RM2255 型切片機(jī)CS-VI 型攤片烤片機(jī);DAB 酶底物顯色試劑盒及SP 試劑盒均購(gòu)自福建邁新生物技術(shù)有限公司;閱片使用Olympus 顯微鏡。

1.3 免疫組織化學(xué)染色 每例組織均取4 μm 厚切片5 張，其中3 張行DPC4 及PTEN 免疫組化染色，1張行HE 染色，另外用PBS 代替一抗作為陰性對(duì)照。切片常規(guī)脫蠟，置于3%過氧化氫中浸泡10 min，使用梯度酒精脫水。高溫高壓熱修復(fù)維持15 min，后經(jīng)自然冷卻至25 ℃。加入一定量的一抗，10%山羊血清封閉20 min，4 ℃冰箱過夜，后滴加50 μl 生物素標(biāo)記的二抗，25 ℃孵育10 min。DAB 顯色，顯微鏡下觀察，蒸餾水終止反應(yīng)。蘇木素輕度復(fù)染，0.1%酒精分化，使用梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.4 結(jié)果判定 DPC4 和PTEN 陽(yáng)性表達(dá)為淺黃色、棕黃色或棕褐色顆粒，均定位于細(xì)胞漿內(nèi)。(1)依據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)分:無染色計(jì)0 分，淺黃色計(jì)1 分，棕黃色計(jì)2 分，棕褐色計(jì)3 分;(2)按照陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占全部細(xì)胞數(shù)百分比計(jì)分:＜5%計(jì)0 分，5% ～20%計(jì)1分，21% ～50%計(jì)2 分，51% ～70%計(jì)3 分，＞71%計(jì)4分。兩者評(píng)分相乘:0 ～3 分設(shè)為陰性(-);4、6 分為陽(yáng)性(+)，8、9、12 分為強(qiáng)陽(yáng)性(+ +)［4］。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，DPC4、PTEN 蛋白水平用χ2檢驗(yàn)，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;采用Spearman 相關(guān)性分析DPC4 與PTEN 蛋白之間的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 DPC4 和PTEN 蛋白的表達(dá) DPC4 陽(yáng)性表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色或棕褐色染色。在正常胃黏膜和胃癌組織中DPC4 的陽(yáng)性表達(dá)率分別為96.7%和43.3%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.16，P ＜0.05)。PTEN 陽(yáng)性表達(dá)主要定位于細(xì)胞漿，呈棕黃色染色。在正常胃黏膜中PTEN 的陽(yáng)性表達(dá)率為93.3%，在胃癌組織中為38.3%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.53，P ＜0.05，見圖1)。

圖1 DPC4 及PTEN 在胃癌組織中的表達(dá)(100 ×) A:DPC4;B:PTENFig 1 Expression of DPC4 and PTEN in gastric cancer (100 ×) A:DPC4;B:PTEN

2.2 DPC4、PTEN 蛋白的表達(dá)與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 胃癌組織中，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性組中DPC4、PTEN 蛋白表達(dá)水平均高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性組(P ＜0.05);DPC4、PTEN 蛋白的表達(dá)隨臨床分期的升高而降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05);漿膜層中DPC4、PTEN 蛋白表達(dá)水平低于肌層，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05);DPC4、PTEN 蛋白的表達(dá)水平與年齡、性別無相關(guān)性(P ＞0.05，見表1)。

表1 DPC4 和PTEN 蛋白的表達(dá)與胃癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系［例數(shù)(%)］Tab 1 Expressions of DPC4 and PTEN in gastric cancer and their relationships with the pathology［n(%)］

續(xù)表1

2.3 胃癌組織中DPC4、PTEN 蛋白表達(dá)的相關(guān)性經(jīng)Spearman 相關(guān)性分析，胃癌組織中PTEN 蛋白表達(dá)與DPC4 蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.827，P ＜0.05)。

3 討論

胃癌的演進(jìn)是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及多種相關(guān)基因的調(diào)控［1］。DPC4 基因位于人染色體18q21.1，含11個(gè)外顯子和10 個(gè)內(nèi)含子，基因編碼產(chǎn)物DPC4 蛋白是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β 超家族受體的底物，具有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移及細(xì)胞生長(zhǎng)等作用，研究發(fā)現(xiàn)該基因缺失或突變可使TGF-β 超家族成員表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞異常增生或癌變［5-6］。也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)DPC4 基因的缺失或突變多發(fā)生在腫瘤進(jìn)展期，并與癌細(xì)胞浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［7］。而本研究發(fā)現(xiàn)DPC4 蛋白在胃癌中呈低表達(dá)。因此，我們認(rèn)為DPC4 蛋白低表達(dá)也可能獨(dú)立阻滯腫瘤的浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移，在胃癌中，DPC4 蛋白可被視為一個(gè)獨(dú)立的腫瘤抑制蛋白。然而另一個(gè)與胃癌關(guān)系密切的PTEN 蛋白在胃癌發(fā)生、發(fā)展過程中扮演的角色尚未明確。該基因的突變、缺失及甲基化對(duì)細(xì)胞增生的負(fù)向調(diào)控和抑癌作用的喪失引起腫瘤的進(jìn)展［8-9］。本研究證實(shí)PTEN 蛋白在正常胃黏膜組織中的陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于胃癌組織，這一結(jié)論與Liu 等［10］報(bào)道相似，表明PTEN 蛋白在胃癌發(fā)生、發(fā)展過程起重要作用。本研究同時(shí)還發(fā)現(xiàn)胃組織中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性的PTEN 蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性者，PTEN 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率隨癌細(xì)胞浸潤(rùn)深度的加深而減弱，在胃癌組織中，PTEN 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率隨臨床分期的升高逐漸降低，上述均表明PTEN 蛋白的表達(dá)可能與胃癌的局部浸潤(rùn)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)PTEN 蛋白陽(yáng)性表達(dá)的胃癌組織中，DPC4 蛋白的陰性率顯著高于PTEN 蛋白陰性表達(dá)的胃癌組織中DPC4蛋白的陰性率，這說明DPC4 基因的缺失或突變阻斷PTEN 蛋白抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，而這種阻斷作用又可能通過負(fù)反饋?zhàn)饔檬拱┘?xì)胞自分泌PTEN 蛋白增加，進(jìn)而調(diào)節(jié)胃癌的發(fā)生、發(fā)展，具體機(jī)制需進(jìn)一步研究。

總之，本研究提示DPC4 蛋白與PTEN 蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，兩者在胃癌組織中均發(fā)揮抑癌基因的作用。因此，分析胃癌組織標(biāo)本中PTEN、DPC4 蛋白的表達(dá)情況，對(duì)于評(píng)估胃癌的發(fā)展及預(yù)后判斷具有重要意義，也為臨床治療胃癌提供了一條新的思路。

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