迷走神經(jīng)切斷對犬急性壞死性胰腺炎血清細(xì)胞因子的影響

劉偉峰，孫君軍，褚智杰，許萬方，楊延輝，戚世芳，鄭 佳，趙德寶，楊 成

河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院1.普外一科;2.婦產(chǎn)科，河南 洛陽471003;3.洛陽市第七人民醫(yī)院

急性壞死性胰腺炎(acute necrotizing pancreatitis，ANP)發(fā)病急、死亡率高，是臨床常見的急腹癥［1］。在ANP 發(fā)病機(jī)理的研究中，“炎癥介質(zhì)學(xué)說”是解釋ANP發(fā)病過程的主要學(xué)說之一［2-3］。近來研究發(fā)現(xiàn)一系列通過神經(jīng)介導(dǎo)的抗炎通路，本研究通過制作犬的ANP模型，切斷迷走神經(jīng)前后干監(jiān)測血清細(xì)胞因子水平的變化，為神經(jīng)干預(yù)治療ANP 提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料

1.1 實(shí)驗分組 雜種雄性犬26 只，經(jīng)河南科技大學(xué)實(shí)驗動物管理委員會許可，由河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物中心提供，年齡2 ～3 歲，體質(zhì)量10 ～15 kg，提前2周分批提取，自由飲水并給予標(biāo)準(zhǔn)食物，進(jìn)行健康體檢確保所提取動物質(zhì)量。根據(jù)實(shí)驗方法隨機(jī)分為:假手術(shù)組6 只;對照組10 只，實(shí)驗途中死亡2 只;迷走神經(jīng)切斷組10 只，實(shí)驗途中死亡4 只;途中死亡犬放棄數(shù)據(jù)統(tǒng)計。假手術(shù)組進(jìn)行開關(guān)腹及十二支腸切開主胰管插管但不造模，對照組制作ANP 動物模型，迷走神經(jīng)切斷組行ANP 模型制作并行迷走神經(jīng)前后干切斷術(shù)。

1.2 試劑和儀器 犬TNF-α、IL-1β、和IL-10 酶聯(lián)免疫吸附試劑盒由美國RD 公司提供;血清淀粉酶試劑盒由上海豐匯醫(yī)學(xué)科技有限公司提供;牛黃膽酸鈉和胰蛋白酶由美國Sigma 公司提供;鹽酸賽拉嗪注射液由吉林省華牧動物保健品有限公司提供;河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科提供全自動酶標(biāo)儀，型號為意大利SEAC-ALISEI.Q.S，日本日立公司生產(chǎn)的全自動生化分析儀，型號為7600-020，廣西威利方舟科技有限公司生產(chǎn)的自動微量推注泵。

1.3 模型制作 制模前所有動物12 h 禁食、4 h 禁飲，隨機(jī)分組。以鹽酸賽拉嗪注射液(0.06 ml/kg)肌注麻醉，麻醉滿意后，將犬仰臥位固定于潔凈手術(shù)實(shí)驗臺上，開始以下操作。采用三步法建立各組動物實(shí)驗?zāi)Ｐ?。第一?ANP 誘導(dǎo)前準(zhǔn)備:常規(guī)腹部消毒鋪巾，采用右肋緣下斜切口(下至游肋前緣，內(nèi)上至劍突下)，逐層進(jìn)腹，打開腹腔后，迷走神經(jīng)切斷組動物于賁門口處，解剖分離出迷走神經(jīng)前干和后干，分別用小直角鉗挑起并掛線備用。假手術(shù)組和對照組動物的腹部操作與迷走神經(jīng)切斷組相似，但免去掛線步驟。隨后操作各組均相同:取距幽門10 ～12 cm 處縱形切開十二指腸前外側(cè)腸壁約2 cm，于十二指腸降部的腸腔內(nèi)后壁黏膜面可見1.0～1.5 mm 直徑的白色臍樣凹陷，即為副乳頭(主胰管開口處)，沿副乳頭開口插入直徑1 ～2 mm 的塑料導(dǎo)管深4 ～5 cm 左右，開始下步操作。第二步:誘導(dǎo)ANP:對照組迷走神經(jīng)和切斷組動物生命體征平穩(wěn)后，用手在腸外固定已置入主胰管的塑料導(dǎo)管，在無菌條件下經(jīng)微量推注泵(調(diào)整好壓力后)，向主胰管內(nèi)以7.68 kPa 恒壓注入5%的牛磺膽酸鈉(0.5 ml/kg)和胰蛋白酶(4 000 U/kg)的混合液，注射完畢后，停留5 min，觀察胰腺變化情況，可見胰腺包膜下點(diǎn)狀或片狀出血、壞死，表明建立ANP 模型成功［4］。假手術(shù)組動物則以相同速度和壓力向塑料導(dǎo)管注入等量的生理鹽水。然后各組均拔除塑料導(dǎo)管并仔細(xì)縫合十二指腸側(cè)壁切口。第三步:完成動物實(shí)驗?zāi)Ｐ?迷走神經(jīng)切斷組:ANP 模型制備成功，觀察10 min，然后提起所有掛線，逐個剪斷迷走神經(jīng)前后干。最后3 組動物逐層關(guān)閉腹壁切口并消毒包扎。實(shí)驗?zāi)Ｐ椭苽渫瓿伞?/p>

1.4 術(shù)后維護(hù)支持及管理 全部動物制模完成后，禁食，不禁水。放置于清潔、循環(huán)良好、保持室溫23 ℃、濕度61%的標(biāo)準(zhǔn)動物實(shí)驗室內(nèi)。同時注意觀察犬生命體征及手術(shù)刀口情況。按比例輸注生理鹽水、葡萄糖、維生素、氯化鉀等營養(yǎng)成分，50 ml/kg，同時補(bǔ)足每天體液丟失量，以維持犬的生理需要，分別在術(shù)前2 h、術(shù)后12 h、24 h、2 d、3 d、5 d、7 d 7 個時間點(diǎn)分別抽血3 ml，監(jiān)測犬的血淀粉酶，留取血清樣本備查，并連續(xù)觀察生命狀況7 d。

1.5 檢測方法 對各組動物的各個時間點(diǎn)所抽血液進(jìn)行高速離心，并留取血清樣本，對留取的血清樣本進(jìn)行低溫保存，及時用酶聯(lián)免疫吸附法測定血清TNF-α、IL-1β、IL-10 的含量。觀察不同實(shí)驗組之間及相同實(shí)驗組不同時間點(diǎn)之間細(xì)胞因子的動態(tài)變化。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件包進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)用s 表示，作重復(fù)測量方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 術(shù)前各組細(xì)胞因子的比較 術(shù)前2 h，各組TNFα、IL-1β、IL-10 的血清濃度相比，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)，各組之間具有可比性(見圖1)。

圖1 TNF-α、IL-1β、IL-10 在術(shù)前2 h 血清濃度比較Fig 1 Comparison of serum concentrations of TNF-α，IL-1β，IL-10 in preoperative 2 hours

2.2 術(shù)后各組TNF-α 比較 術(shù)后對照組的TNF-α 血清濃度與假手術(shù)組相比明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05);迷走神經(jīng)切斷組與對照組相比明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.001);術(shù)后6 個時間點(diǎn)間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F =229.16，P =0);術(shù)后3 組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F =583.76，P =0);術(shù)后3組6 個時間點(diǎn)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F =35.93，P=0);假手術(shù)組、對照組在術(shù)后2 d 出現(xiàn)峰值，并呈逐漸下降趨勢，迷走神經(jīng)切斷組在術(shù)后24 h、3 d 出現(xiàn)雙峰值，并呈下降趨勢(見圖2A ～2B)。

2.3 術(shù)后各組IL-1β 比較 術(shù)后對照組的IL-1β 血清濃度與假手術(shù)組相比明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05);迷走神經(jīng)切斷組與對照組相比明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P =0.022);術(shù)后6 個時間點(diǎn)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F =254.09，P =0);術(shù)后3 組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F =183.34，P =0);術(shù)后3組6 個時間間點(diǎn)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F =24.33，P=0);各組均在術(shù)后24 h 出現(xiàn)峰值，且24 h 后均呈下降趨勢(見圖2C ～2D)。

2.4 術(shù)后各組IL-10 比較 術(shù)后對照組的IL-10 血清濃度和假手術(shù)組相比明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);迷走神經(jīng)切斷組與對照組相比明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P =0.016);術(shù)后6 個時間點(diǎn)間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=64.63，P=0);術(shù)后3 組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F =14.28，P =0);術(shù)后3 組6個時間點(diǎn)間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F =4.29，P =0)。各組均在術(shù)后2 d 出現(xiàn)峰值，且2 d 后均呈下降趨勢(見圖2E ～2F)。

圖2 TNE-α、IL-1β、IL-10 在術(shù)后各時間點(diǎn)各組血清濃度的變化趨勢Fig 2 The trends of serum concentrations of TNE-α，IL-1β，IL-10 in three groups after the operation

3 討論

選用犬作為研究對象，是由于一方面其體型較大，較接近人的病理生理，另一方面其耐受性好，易于實(shí)驗順利進(jìn)行。實(shí)驗中發(fā)現(xiàn)各組在術(shù)前2 h TNF-α、IL-1β、IL-10 的血清濃度均在較低水平，各因子在各組中并無明顯差異;對照組術(shù)后各時段細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-10 血清濃度與假手術(shù)組相比均明顯升高，充分說明ANP 發(fā)生的早期就伴隨著細(xì)胞因子的大量產(chǎn)生，符合ANP 的“炎癥介質(zhì)學(xué)說”，炎癥反應(yīng)的發(fā)生伴隨著細(xì)胞因子的大量產(chǎn)生，細(xì)胞因子一致被認(rèn)為是誘發(fā)和加重ANP 的關(guān)鍵［5-6］，進(jìn)而形成瀑布樣惡性循環(huán)［7］;迷走神經(jīng)切斷組術(shù)后各時段細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β 與對照組相比明顯升高，而IL-10 與對照組相比明顯降低;現(xiàn)有研究表明腫瘤壞死因子(TNF)、白細(xì)胞介素-1(IL-1)是急性胰腺炎病程中的關(guān)鍵性促炎因子［8］，IL-10 是炎癥反應(yīng)中由免疫細(xì)胞產(chǎn)生的抗炎因子［9］。本實(shí)驗證實(shí)迷走神經(jīng)切斷后，改變了伴隨ANP 所產(chǎn)生的促炎因子和抗炎因子的變化格局。

Borovikova 等［10］在2000 年Nature 上首次提出了“膽堿能抗炎通道”的理論;Tracey［11］也提出迷走神經(jīng)的活動是調(diào)節(jié)細(xì)胞因子平衡的關(guān)鍵，平衡使組織修復(fù)，不平衡導(dǎo)致組織損傷。ANP 發(fā)生的早期，機(jī)體就出現(xiàn)促炎因素和抗炎因素的較量。促炎因子可以刺激迷走神經(jīng)的傳入神經(jīng)信號，使信號傳至延髓網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、籃斑、下丘腦和背側(cè)迷走神經(jīng)復(fù)合體，激活中樞神經(jīng)，產(chǎn)生一系列神經(jīng)促炎和抗炎反射［12］，包括“下丘腦-垂體-腎上腺軸”抗炎通路、交感神經(jīng)抗炎促炎通路、膽堿能抗炎通路，其中膽堿能抗炎通路是最重要的一條抗炎通路。迷走神經(jīng)切斷后，犬的膽堿能抗炎通路的完整性遭到破壞，迷走神經(jīng)的抗炎作用消失，“下丘腦-垂體-腎上腺軸”抗炎作用減弱，因神經(jīng)張力平衡消失，使交感神經(jīng)亢進(jìn)，誘發(fā)了機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的全身炎癥反應(yīng)。

ANP 時胰腺細(xì)胞壞死崩解產(chǎn)生的大量富含胰酶的炎性液向胰外滲漏侵襲刺激胰周間隙內(nèi)豐富的內(nèi)臟神經(jīng)節(jié)、叢，相關(guān)神經(jīng)系勢必會有應(yīng)答。胰腺的傳出神經(jīng)主要為交感神經(jīng)系的內(nèi)臟大、小神經(jīng)和右迷走神經(jīng)的腹腔支，其傳入神經(jīng)與傳出神經(jīng)纖維混合走行。免疫系統(tǒng)與內(nèi)臟神經(jīng)系統(tǒng)也存在著復(fù)雜的相互作用，內(nèi)臟神經(jīng)系統(tǒng)充當(dāng)了聯(lián)系中樞神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的橋梁作用［13］。臟器發(fā)生炎性病變時，內(nèi)臟神經(jīng)就會作出相關(guān)反應(yīng)，會把信號傳至中樞神經(jīng)系統(tǒng)，影響免疫系統(tǒng)對炎癥的應(yīng)答［12］。ANP 的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程中，也是破壞“免疫-神經(jīng)-內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)”［14］穩(wěn)定性的過程，當(dāng)然“免疫-神經(jīng)-內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)”的穩(wěn)定也是抑制ANP發(fā)生、發(fā)展的有力保障。

本實(shí)驗顯示，迷走神經(jīng)切斷確實(shí)增加ANP 犬的血清促炎因子的釋放、降低抗炎因子的釋放。本實(shí)驗從反面證實(shí)了迷走神經(jīng)在維持“免疫-神經(jīng)-內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)”的完整性和穩(wěn)定性中起著重要作用，為治療ANP提供一條嶄新的途徑，但是高效的神經(jīng)干預(yù)治療ANP的方法有待進(jìn)一步研究。

［1］ Wittau M，Mayer B，Scheele J，et al. Systematic review and meta-analysis of antibiotic prophylaxis in severe acute pancreatitis［J］. Scand J Gastroenterol，2011，46(3):261-270.

［2］ Bhatia M，Brady M，Shokuhi S，et al. Inflammatory mediators in acute pancreatitis［J］. J Pathol，2000，190(2):117-125.

［3］ Chen JH，Chen K，Wang H. Advances in the pathogenesis of acute pancreatitis［J］. World Chinese Journal of Digestology，2009，17(24):2478-2483.陳婧華，陳墾，王暉. 急性胰腺炎發(fā)病機(jī)制研究進(jìn)展［J］. 世界華人消化雜志，2009，17(24):2478-2483.

［4］ Wu CT，Li ZL. Anatomy of main pancreatic duct of hybrid dog and acute pancreatitis model ［J］. World Chinese Journal of Digestology，1999，7(1):62-63.吳承堂，黎沾良. 雜種狗主胰管的解剖及胰腺炎模型制作［J］. 世界華人消化雜志，1999，7(1):62-63.

［5］ Zhang XP，Li ZJ，Zhang J，et al. Inflammatory mediators and microcirculatory disturbance in acute pancreatitis［J］. Hepatobiliary Pancreat Dis Int，2009，8(4):351-357.

［6］ Makhija R，Kingsnorth AN. Cytokine storm in acute pancreatitis［J］.J Hepatobiliary Pancreat Surg，2002，9(4):401-410.

［7］ Zhou Y，Hu GY，Wang XP. Research progress of chemokines in acute pancreatitis ［J］. Chin J Gastroenterol Hepatol，2013，22 (4):295-297.周云，胡國勇，王興鵬. 趨化因子在急性胰腺炎中的研究進(jìn)展［J］.胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志，2013，22(4):295-297.

［8］ Norman J. The role of cytokines in the pathogenesis of acute pancreatitis［J］. Am J Surg，1998，175(1):76-83.

［9］ Moore KW，de Waal Malefyt R，Coffman RL，et al. Interleukin-10 and the interleukin-10 receptor［J］. Annu Rev Immunol，2001，19(8):683-765.

［10］ Borovikova LV，Ivanova S，Zhang M，et al. Vagus nerve stimulation attenuates the systemic inflammatory response to endotoxin［J］. Nature，2000，405(6785):458-462.

［11］ Tracey KJ. Physiology and immunology of the cholinergic antiinflammatory pathway［J］. J Clin Invest，2007，117(2):289-296.

［12］ Tracey KJ. The inflammatory reflex［J］.Nature，2002，420(6917):853-859.

［13］ Steinman L. Elaborate interactions between immune and nervous systems［J］.Nat Immunol，2004，5(6):575-581.

［14］ Besedovsky H，Sorkin E. Network of immunneuroendocrine interaction［J］. Clin Exp Immunol，1977，27(1):1-12.