上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換與血管生成擬態(tài)形成在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及臨床意義

李珍杰，李建生，張金平，保 潔，李東穎

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化科，河南 鄭州450052

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤，其惡性程度高，總體預(yù)后較差［1］。HCC 預(yù)后差主要與其富有血管并有較強(qiáng)的侵襲性有關(guān)。上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)變(epishelial-mesenchymal transition，EMT)是上皮細(xì)胞失去其特點(diǎn)獲得間充質(zhì)細(xì)胞表型的細(xì)胞骨架重塑過(guò)程。EMT 過(guò)程包括:上皮細(xì)胞失去極性、細(xì)胞與細(xì)胞黏附性降低、細(xì)胞骨架的重塑，最終獲得遷移表型。EMT 主要分子特征為上皮細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)水平的下調(diào)和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)水平的上調(diào)［2］。已有研究表明EMT 與多種腫瘤的預(yù)后及轉(zhuǎn)移有關(guān)［3-4］。但目前的研究主要集中在EMT 導(dǎo)致的腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移方面，而參與血管生成的研究報(bào)道極少?；诖?，我們應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)從蛋白質(zhì)水平檢測(cè)人HCC 中血管生成擬態(tài)(vasculogenic mimicry，VM)、E-cadllerin 的表達(dá)，分析其與HCC 的侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后關(guān)系，初步探討VM 形成的可能機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院2000 年1 月-2009 年6 月經(jīng)手術(shù)切除、臨床病理資料及預(yù)后資料完整的HCC 患者200 例，男164 例，女36 例，年齡20 ～78 歲，平均年齡(49 ±12.56)歲;其中病理學(xué)分期Ⅰ、Ⅱ期患者79 例，Ⅲ、Ⅳ期患者121 例;腫瘤大小≤5 cm 者103 例，＞5 cm 者97 例;術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移105 例，無(wú)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移95 例。所有患者術(shù)前均未行介入、化療等輔助治療，隨訪時(shí)間截止到2013 年5 月。200 例HCC 患者的一般情況如表1 所示。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑:兔抗人單克隆抗體CD31、PAS 染色液購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz 公司。兔抗人E-cadherien 抗體購(gòu)自北京中杉生物技術(shù)公司。

1.2.2 免疫組化染色:CD31/PAS 雙重染色方法，石蠟切片常規(guī)脫蠟水化后，按照SP 法操作，進(jìn)行CD31免疫組化染色，DAB 染色至血管內(nèi)皮細(xì)胞著色后，終止反應(yīng)。過(guò)碘酸溶液中氧化，再行PAS 染色。

E-cadherien 免疫組化染色及結(jié)果判斷:石蠟切片脫蠟水化，高溫抗原修復(fù)，加兔抗人E-cadherien 抗體(1∶100)，按照SP 免疫組化試劑盒要求操作。DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹(shù)脂封固。結(jié)果判定參照Mattem 積分法，即陽(yáng)性細(xì)胞百分率:每例標(biāo)本選擇10 個(gè)含有陽(yáng)性細(xì)胞的高倍視野，0 為無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞;1 為陽(yáng)性細(xì)胞≤25%;2 為陽(yáng)性細(xì)胞≤50%;3 為陽(yáng)性細(xì)胞＞50%。染色強(qiáng)度:0 為陰性;1 為淺黃色;2 為深黃色;3為棕黃色。染色指數(shù)為二者之和。陽(yáng)性表達(dá)指數(shù)＞3定為免疫組化染色陽(yáng)性;≤3 定為陰性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，分類(lèi)資料采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)分析采用Pearson 相關(guān)分析，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HCC 組織中VM 情況 200 例HCC 組織中38例存在VM，陽(yáng)性率為19.0%。CD31/PAS 雙重染色可見(jiàn)一層PAS 陽(yáng)性物質(zhì)圍成基底膜樣結(jié)構(gòu)(見(jiàn)圖1)。VM 的表達(dá)與腫瘤患者的性別、年齡無(wú)關(guān)(P ＞0.05)。與腫瘤的大小、病理學(xué)分期、術(shù)后復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)(P ＜0.05，見(jiàn)表1)。

表1 HCC 患者臨床病理特征與VM、E-cadherien 表達(dá)的關(guān)系Tab 1 The relationship of VM，E-cadherien expression and clinical pathological characteristics

2.2 HCC 組織中E-cadherien 的表達(dá)情況 HCC 組織中E-cadherien 表達(dá)97 例，陽(yáng)性率為48.5%，表達(dá)于細(xì)胞膜，陽(yáng)性產(chǎn)物為棕黃色顆粒，其表達(dá)與腫瘤的大小、病理學(xué)分期、TNM 分期、術(shù)后復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移有關(guān)(P ＜0.05)。而與患者的性別、年齡無(wú)關(guān)(P ＞0.05，見(jiàn)表1、圖2 ～3)。

2.3 VM 陽(yáng)性表達(dá)與E-cadherien 表達(dá)關(guān)系 Pearson 相關(guān)性分析顯示:VM 的表達(dá)與E-cadherien 的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.02，見(jiàn)表2)。

表2 VM 與E-cadherien 的關(guān)系Tab 2 The relationship between VM and E-cadherien

圖1 CD31/PAS 染色VM 的表達(dá)(200 ×)(黑色箭頭所指為血管，紅色箭頭所指為VM);圖2 VM 陰性組E-cadherien 的陽(yáng)性表達(dá)(400 ×);圖3 VM 陽(yáng)性組E-cadherien 的陰性表達(dá)(400 ×)Fig 1 VM expression was identified by CD31/PAS double-staining (200 ×);Fig 2 Negative VM with positive E-cadherin expression (400 ×);Fig 3 Positive VM with negative E-cadherin expression (400 ×)

3 討論

腫瘤的生長(zhǎng)依賴(lài)血管生成［5］。經(jīng)典的血管生成途徑為血管發(fā)生及血管再生。經(jīng)典的腫瘤血管生成理論認(rèn)為:當(dāng)腫瘤直徑＞2 mm 時(shí)，需要構(gòu)建血管獲取血供，否則腫瘤就會(huì)因?yàn)槿毖毖醢l(fā)生壞死。但在1999年，美國(guó)Maniotis 根據(jù)對(duì)人眼葡萄膜黑色素瘤微循環(huán)的研究，首次提出了一種與經(jīng)典的腫瘤血管生成途徑完全不同、不依賴(lài)機(jī)體內(nèi)皮細(xì)胞的全新腫瘤微循環(huán)模式，即VM 的概念，VM 是指某些高度惡性腫瘤細(xì)胞通過(guò)自身變形模擬血管內(nèi)皮細(xì)胞并與細(xì)胞外基質(zhì)相互作用，模仿血管壁結(jié)構(gòu)形成可以運(yùn)輸血液(血漿、紅細(xì)胞)的管道系統(tǒng)，從而重塑腫瘤微循環(huán)，并與宿主血管相連使腫瘤獲得血液供應(yīng)的一種現(xiàn)象。研究報(bào)道，在多種惡性腫瘤組織均存在VM［6］。并有研究證實(shí)肝癌中存在VM［7］，其與病理學(xué)分期及預(yù)后有關(guān)。但VM形成的機(jī)制及調(diào)控因素研究較少。本研究應(yīng)用CD31/PAS 雙重染色證實(shí)HCC 中存在VM。VM 為CD31 染色陰性，PAS 陽(yáng)性的管狀結(jié)果，其內(nèi)可見(jiàn)紅細(xì)胞。且其多位于腫瘤內(nèi)部，管道內(nèi)部很少觀察到微血栓，表明其可為腫瘤供血，使腫瘤能夠在宿主環(huán)境中無(wú)壞死性生長(zhǎng)。VM 的表達(dá)與性別、年齡無(wú)關(guān)，與分化程度及肝癌的轉(zhuǎn)移有關(guān)，且與患者術(shù)后5 年生存率有關(guān)，陽(yáng)性率高于高度分化組，說(shuō)明VM 是HCC 預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素，干擾VM 的形成可能有助于改善HCC 患者預(yù)后。

上皮來(lái)源的腫瘤細(xì)胞可通過(guò)EMT 過(guò)程失去彼此之間的鏈接，獲得間充質(zhì)細(xì)胞的表型和遷移功能，腫瘤細(xì)胞也因此具備侵襲和轉(zhuǎn)移能力，故EMT 被認(rèn)為在腫瘤的生長(zhǎng)和演進(jìn)中起到了重要作用［8］。E-cadherin 是上皮組織中的一種細(xì)胞間跨膜粘連糖蛋白分子，Ecadherin 表達(dá)的丟失被認(rèn)為是EMT 最顯著的特征。本研究表明:E-cadherin 的表達(dá)與HCC 分期、血管侵犯有關(guān)，與相關(guān)研究［9］相符。HCC E-cadherin 表達(dá)下降，即EMT 的發(fā)生可使HCC 細(xì)胞間結(jié)構(gòu)松散，細(xì)胞更易發(fā)生解離，并且增加細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性，從而使細(xì)胞侵入周?chē)M織，促進(jìn)HCC 的侵襲和轉(zhuǎn)移。其與HCC 術(shù)后復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移有關(guān)，可證實(shí)E-cadherien 的高表達(dá)可對(duì)HCC術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移有保護(hù)作用，E-cadherien 的下調(diào)可作為判定HCC 患者預(yù)后不良的指標(biāo)。

研究結(jié)果表明，VM 的表達(dá)與E-cadherien 的表達(dá)有很好的相關(guān)性，推測(cè)E-cadherien 表達(dá)的下調(diào)即EMT的發(fā)生可能促進(jìn)VM 的產(chǎn)生。推測(cè)肝癌細(xì)胞或可通過(guò)EMT 過(guò)程發(fā)生細(xì)胞自身的塑形，從而獲得構(gòu)建VM 的能力。抑制E-cadherien 下調(diào)表達(dá)可能干預(yù)VM 形成，為腫瘤的治療提供新的靶點(diǎn)。

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