胃癌MSCT 征象與VEGF-C、VEGFR-3 表達關(guān)系的研究

丁昌懋，張惠宇，孫慧芳，于 湛，高劍波

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院放射科，河南 鄭州450052

每年世界新發(fā)胃癌100 余萬，中國占42%;因胃癌死亡約80 萬，中國占35%，中國的胃癌發(fā)病率和死亡率是世界平均水平2 倍多，發(fā)病的高峰年齡在50 ～80 歲。胃癌療效與病期早晚和診治方法及手段密切相關(guān)，早期胃癌經(jīng)足夠的治療后90%以上患者能生存5 年以上或治愈，而晚期胃癌患者，治療后5 年生存率不足5%［1］。淋巴轉(zhuǎn)移是決定胃癌能否手術(shù)切除及其預(yù)后的重要因素之一。MSCT 增強掃描能夠很客觀地反映胃癌的大體病理特征，使腫瘤組織病理學(xué)特點得到比較客觀、完整的反映［2］。近年來很多體外及體內(nèi)實驗研究表明血管內(nèi)皮生長因子C(vascular endothelial growth factor-C，VEGF-C)具有促進人體及動物組織淋巴管生成的作用，成熟組織中它呈低表達或陰性表現(xiàn)，但多種惡性腫瘤細胞都出現(xiàn)高度表達VEGF-C 的特征。VEGF-C 蛋白通過與位于淋巴管內(nèi)皮細胞表面的血管內(nèi)皮生長因子受體3(vascular endothelial growth factor receptor-3，VEGFR-3)結(jié)合，從而引起淋巴管內(nèi)皮細胞的增生及淋巴管的生成，它們之間具有協(xié)同作用。兩者的高表達對惡性腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移，特別是淋巴管轉(zhuǎn)移有明顯的促進作用。本實驗將胃癌的MSCT 各種征象與其組織病理、VEGF-C 及VEGFR-3 表達進行對照研究，總結(jié)它們之間的關(guān)系，從而進一步理解胃癌MSCT 征象的分子病理學(xué)基礎(chǔ)，為臨床上分子生物學(xué)治療提供更多有價值的信息。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院2011 年9 月-2012 年12 月行胃大部切除或全胃切除術(shù)的胃癌患者58 例，女21 例，男37 例，年齡32 ～76 歲，中位年齡47.5 歲，早期胃癌8 例，進展期50 例。所有患者手術(shù)前均行MSCT 平掃及增強掃描，標(biāo)本于術(shù)后離體30 min 以內(nèi)取材，置于液氮中冷凍，后置于-80 ℃低溫冰箱中保存。取材包括所有患者的腫瘤組織及其中30 例經(jīng)病理證實切緣無腫瘤細胞浸潤的切緣正常胃壁組織?；颊咝g(shù)前均未進行任何化療及放療。

1.2 MSCT 檢查 所有患者CT 掃描均在GE Lightspeed VCT 機上完成，檢查前飲水800 ～1 000 ml 后行平掃及三期動態(tài)增強掃描。分別于開始注射對比劑后20 s、60 s 及2 min 采集圖像。掃描參數(shù)為120 kV，240 mAs，準(zhǔn)直5 mm，Pitch=1。對比劑采用歐乃派克(300 mgI/ml)100 ml，注射速率3.0 ml/s。

1.3 RT-PCR 法檢測VEGF-C、VEGFR-3 表達 新鮮腫瘤組織及癌旁正常黏膜組織總RNA 提取按照抽提試劑Trizol(美國Invitrogen 公司產(chǎn)品)的說明操作并檢測RNA 的質(zhì)量。逆轉(zhuǎn)錄及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒、VEGF-C、VEGFR-3 及β-actin 的特異引物均有上海生物工程有限公司提供。VEGF-C 擴增片斷長度340 bp:上游引物5＇-CCAGTGTAGATGAACTCATG-3，下游引物5＇-CTGGTGTTCATGCACTGCAG-3＇;VEGFR-3 擴增片斷長度300 bp:上游引物5＇-CATCGAGAGCCTGGACACCT-3＇，下游引物5＇-TCGTGCAGCGTGGACAGGTT-3＇;β-actin 擴增片斷長度500 bp:上游引物5＇-GTGGGGCGCCCCGGCACCA-3＇，下 游 引 物5＇-CTCCTTAATGTCACGCACGATTT-3＇。

反應(yīng)條件:(1)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA:冰浴下2 μg 總RNA 中加入隨機六聚引物1 μl，再加入RNase-free ddH2O 定容至11 μl?；靹蚝?0 ℃水浴5 min 后冰浴30 s，再按順序加入5 ×buffer 4 μl，Rnase Inhibitor 1 μl，dNTPMix 2 μl，混勻后37 ℃水浴5 min，加入1 μl AMV，25 ℃水浴10 min，42 ℃水浴60 min，70 ℃加熱10 min 結(jié)束反應(yīng)。(2)PCR 條件:94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性50 s，退火30 s、72 ℃延伸60 s，35 個循環(huán)，72 ℃延伸5 min。

1.4 胃癌MSCT 分期 N 分期:轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)表現(xiàn):淋巴結(jié)直徑≥10 mm;直徑＜10 mm 伴有顯著強化;增強后淋巴結(jié)呈周邊強化。T 分期:T2 胃壁增厚超過5 mm;胃壁正常分層結(jié)構(gòu)消失;胃壁異常強化，胃壁漿膜面光整，周圍有清晰的脂肪層;T3 病變處胃壁漿膜面毛糙、胃壁外層結(jié)節(jié)狀或不規(guī)則狀增厚;T4 胃壁腫塊與鄰近臟器間脂肪層消失。M 分期:肝臟轉(zhuǎn)移、腹膜轉(zhuǎn)移、腹腔大血管周圍淋巴結(jié)受累，視為遠處轉(zhuǎn)移。

1.5 RT-PCR 結(jié)果判定 2 μl 指示劑與5 μl PCR 產(chǎn)物混勻，點樣1.5%瓊脂糖凝膠電泳板上，電泳時間40 min，電壓80 V，紫外燈下進行凝膠掃描，以出現(xiàn)與目的基因堿基相同的條帶為陽性結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0 軟件包進行分析，以α=0.05 作為顯著性檢驗水準(zhǔn)。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，相關(guān)性檢驗用Spearman 相關(guān)性分析。P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤組織、正常組織VEGF-C mRNA、VEGFR-3 mRNA 的表達 58 例腫瘤標(biāo)本中VEGF-C mRNA 陽性率為74. 14%(43/58)，VEGFR-3 mRNA 陽性率為58.62%(34/58)。正常組織中VEGF-C mRNA 陽性率為50.00%(15/30)，VEGFR-3 mRNA 表達陽性率為33.33%(10/30)。腫瘤組織VEGF-C、VEGFR-3 表達率高于正常組織(P ＜0. 05)。腫瘤組織中VEGF-C mRNA 與VEGFR-3 mRNA 的表達呈正相關(guān)(P ＜0.05，見圖1 ～2、表1 ～2)。

圖1 胃癌組織及正常組織VEGF-C mRNA 的表達 T:腫瘤組織;N:正常組織;M:DNA markFig 1 Expression of VEGF-C mRNA in gastric carcinoma and normal tissues T:gastric carcinoma;N:normal tissues;M:DNA mark

圖2 胃癌組織及正常組織VEGFR-3 mRNA 的表達 T:腫瘤組織;N:正常組織;M:DNA markFig 2 Expression of VEGFR-3 mRNA in gastric carcinoma and normal tissues T:gastric carcinoma;N:normal tissues;M:DNA mark

表1 胃癌組織、正常組織中VEGF-C mRNA、VEGFR-3 mRNA 的表達Tab 1 Expression of VEGF-C mRNA，VEGFR-3 mRNA in gastric carcinoma and normal tissues

2.2 胃癌MSCT 征象與VEGF-C mRNA、VGFR-3 mRNA 的表達 在彌漫型組與腸型組、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中VEGF-C mRNA 陽性表達率分別為87.10%(27/31)和59.26%(16/27)、87.80%(36/41)和41.18%(7/17)，組間比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05);在彌漫型組與腸型組、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中VEGFR-3 mRNA 陽性表達率分別為70.97%(22/31)和44.44%(12/27)、68.29%(28/41)和35.29%(6/17)，組間比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05);有無漿膜侵犯組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05，見表3、圖3 ～4)。

表2 VEGF-C mRNA、VEGFR-3 mRNA 在胃癌組織中的表達關(guān)系Tab 2 Relationship between VEGF-C mRNA and VEGFR-3 mRNA in gastric carcinoma

表3 胃癌組織中VEGF-C mRNA、VEGFR-3 mRNA 表達與MSCT 征象的關(guān)系Tab 3 Relationgship of VEGF-C mRNA，VEGFR-3 mRNA in gastric carcinoma and MSCT findings

圖3 T3N1M0 賁門高分化腺癌 A:平掃;B:動脈期;C:門脈期。可見病灶呈均勻強化，為腸型胃癌特征;小彎側(cè)多個明顯強化稍大淋巴結(jié)Fig 3 T3N1M0 well-differentiated cardiac adenocarcinoma A:plain scan film;B:arterial phase film;C:portal venous phase film.The mass which was enhanced homogeneously in arterial phase expressed features of intestinal gastric carcinoma，many enlarged and significant enhanced lymph nodes were observed in the lesser curvature of stomach

圖4 T3N2M0胃底及胃體低分化腺癌 A:平掃;B:動脈期;C:門脈期?？梢姴∽兎謱訌娀瑒用}期內(nèi)層強化明顯，門脈期趨向均勻，呈彌漫型胃癌特征;胃左動脈周圍見多個輕度強化稍大淋巴結(jié)影Fig 4 T3N2M0 poorl-differentiated adenocarcinoma in the fundus and body of stomach A:plain scan film;B:arterial phase film;C:portal venous phase film. The inner layer of mass was enhanced firstly in arterial phase，the mass was enhanced homogeneously in portal phase，which expressed features of diffuse gastric carcinoma. Many enlarged and mild enhanced lymph nodes were observed around the left gastric artery

3 討論

在消化系統(tǒng)惡性腫瘤死亡病例中，約半數(shù)死于胃癌。早期胃癌發(fā)現(xiàn)非常困難，常常沒有特異癥狀，發(fā)現(xiàn)時多已進入進展期。進展期胃癌的浸潤轉(zhuǎn)移是造成患者死亡的重要原因，所以胃癌生物學(xué)行為及其分子生物學(xué)機制一直是影像學(xué)、病理學(xué)及腫瘤分子生物學(xué)等領(lǐng)域中的重要課題。VEGF-C 又稱為淋巴管生長因子，其基因位于染色體4q34 上，其表達產(chǎn)物是一種含有419 個氨基酸殘基的蛋白，分子量為46.9 KD。在許多惡性腫瘤的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，VEGF-C 的高表達與惡性腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，胃癌也不例外［3-5］。Kurebayashi 等［4］發(fā)現(xiàn)在12 例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌中，9 例表達VEGF-C，而無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者均無VEGF-C 表達。本研究中，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組VEGF-C mRNA 陽性率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，與文獻報道相符合，提示在胃癌的淋巴道轉(zhuǎn)移過程中VEGF-C 有明顯的促進作用。

VEGFR-3 為VEGF-C 的特異性受體，胚胎期表達在所有的內(nèi)皮細胞，隨著胚胎生長發(fā)育成熟，VEGFR-3在血管內(nèi)皮細胞的表達逐漸減少，特別是在成年人體組織中，VEGFR-3 很少或不表達在血管內(nèi)皮，而表達主要局限于淋巴管內(nèi)皮，是淋巴管形成和生長的調(diào)節(jié)因子?，F(xiàn)有研究表明:VEGF-C 與位于淋巴管內(nèi)皮細胞上的特異受體VEGFR-3 結(jié)合并使之激活，從而在淋巴管內(nèi)皮細胞內(nèi)形成一套旁分泌通路，刺激新生淋巴管內(nèi)皮形成，并提高淋巴管的通透性，降低淋巴管內(nèi)皮細胞間的黏附，所以表達VEGF-C 的惡性腫瘤細胞很容易進入新生的淋巴管并轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的淋巴結(jié)［6］。同時，由于腫瘤的不斷生長膨大，腫瘤間質(zhì)內(nèi)部的壓力增加，使缺乏基底膜的淋巴管內(nèi)皮細胞間的間隙加大，也可以促進腫瘤細胞進入淋巴管，從而導(dǎo)致淋巴管轉(zhuǎn)移［7］。本研究采用RT-PCR 方法證實了VEGF-C 及VEGFR-3 在胃癌組織中高表達，兩者高表達的胃癌組織中相應(yīng)的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率明顯增高，證明VEGF-C 及VEGFR-3 的高表達與胃癌的淋巴管生成及淋巴管轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，這與Yonemura 等［8］對胃癌的研究相似。同時本研究顯示分化程度較差的胃癌組織中(病理上多為彌漫型胃癌)VEGF-C、VEGFR-3 的陽性表達率明顯高于分化程度較高的胃癌組織(病理上多為腸型胃癌)，這也表明VEGF-C、VEGFR-3 的表達與腫瘤細胞的分化程度相關(guān):兩者的表達越高，腫瘤分化越差，患者的預(yù)后也就越差。目前惡性腫瘤組織產(chǎn)生VEGF-C的具體機制尚不明了，還有許多地方有待進一步的深入研究，關(guān)于腫瘤淋巴系統(tǒng)轉(zhuǎn)移機制及抗腫瘤新生淋巴管形成的研究已成為熱點。

MSCT 可以實現(xiàn)容積成像，有很高的空間及密度分辨率，在胃癌的診斷中是一種較為安全有效的檢查方法。特別是對于進展期胃癌，術(shù)前常規(guī)MSCT 增強掃描能夠比較完整真實地反映胃癌的大體病理學(xué)特性并提供較準(zhǔn)確的TNM 分期指導(dǎo)，如腫瘤的大小、形態(tài)、厚度、浸潤生長的程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移情況等。胃癌MSCT 圖像不僅是胃癌病理學(xué)相關(guān)特性的反映，同時也可以反映出胃癌組織的有關(guān)分子生物學(xué)特征。本研究顯示胃癌中VEGF-C 及VEGFR-3 高表達者，MSCT 增強時多表現(xiàn)為彌漫型胃癌的特征，且?？梢娏馨徒Y(jié)轉(zhuǎn)移。由于本次研究中發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的病例較少(2 例)，所以遠處轉(zhuǎn)移與VEGF-C 及VEGFR-3 表達有無相關(guān)性有待于擴大樣本量后進一步研究?？傊?，根據(jù)胃癌MSCT 征象，結(jié)合活檢腫瘤組織VEGF-C及VEGFR-3 的表達，可以在治療前對胃癌的浸潤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等做出較完善的評估。這對確立胃癌的個體化治療方案和預(yù)后的評估具有指導(dǎo)意義。

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