外周血T 淋巴細(xì)胞亞群和慢性丙型肝炎患者HCV 復(fù)制程度關(guān)系的研究

馬晨蕓，王克翔

上海市第七人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，上海200137

慢性丙型病毒性肝炎(chronic hepatitis C，CHC)是丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染的世界范圍內(nèi)疾病，其顯著臨床特點(diǎn)是85% ～90%的急性患者將轉(zhuǎn)變?yōu)槁猿掷m(xù)性感染［1-2］。研究證實(shí)，HCV 具有直接的致細(xì)胞病變作用，其致病機(jī)制與宿主的免疫反應(yīng)有密切關(guān)系，其中T 淋巴細(xì)胞及其所分泌的細(xì)胞因子變化顯著影響了HCV 感染的進(jìn)程［3-4］。本文深入探討了外周血T 淋巴細(xì)胞亞群和血清中HCV RNA 復(fù)制載量水平之間的關(guān)系，旨在闡釋CHC 發(fā)病機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2012 年1 月-2014 年1 月上海市第七人民醫(yī)院收治的65 例CHC 患者，男25 例，女40例;年齡34 ～72 歲，平均年齡(42.9 ±15.8)歲。入選標(biāo)準(zhǔn):符合2011 年《丙型肝炎防治指南》的診斷標(biāo)準(zhǔn)［5］;血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)反復(fù)升高;血清HCV RNA(RTPCR 法)和/或抗-HCV(ELISA 法)陽性;近6 個月內(nèi)無免疫調(diào)節(jié)劑應(yīng)用史。排除標(biāo)準(zhǔn):合并有其他病毒性肝炎、自身免疫性疾病等嚴(yán)重性疾病;近6 個月內(nèi)應(yīng)用免疫調(diào)節(jié)劑?；颊甙碒CV RNA 載量水平分為高載量組(HCV RNA ＞1 ×105/ml)、中載量組(1 ×103～1 ×105copies/ml)、低載量組(＜1 ×103copies/ml)。選取健康體檢者25 名作為對照組，男10 名，女15 名，年齡32 ～74 歲，平均年齡(43.2 ±16.2)歲。兩組年齡和性別比例相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 儀器及試劑:流式細(xì)胞儀為美國BD 公司生產(chǎn)的FACSCantoTMⅡ型，PCR 儀為Hema 9600 基因擴(kuò)增儀;CD3/CD4/CD8 熒光標(biāo)記單克隆抗體及紅細(xì)胞裂解液由上海杰一生物有限公司提供，HCV 核酸定量試劑盒由凱杰生物工程(深圳)有限公司提供。

1.2.2 HCV RNA 載量檢測:按操作步驟，采用實(shí)時熒光定量PCR 檢測HCV RNA。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測T 細(xì)胞亞群:取所有患者及健康體檢者外周靜脈血1 ml，及時加入抗凝劑。取100 μl 抗凝靜脈血，加入10 μl 熒光標(biāo)記的單克隆抗體CD3-PerCP/CD4-FITC/CD8-PE，混勻后室溫下避光孵育15 min。加入紅細(xì)胞裂解液250 μl 裂解20 min，離心(1 200 r/min，5 min)，棄去上清液，PBS 洗滌2次，PBS 懸浮細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用s 表示，并行t 檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Spearman 等級相關(guān)分析。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 T 細(xì)胞亞群分布 流式細(xì)胞檢測法測定CHC 患者和健康體檢者T 細(xì)胞亞群分布。CD3+T 細(xì)胞亞群在兩組人群中分布相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05);CD4+T 細(xì)胞亞群在CHC 患者中分布明顯低于健康體檢者(P ＜0.05)，CD8+T 細(xì)胞亞群在CHC 患者中分布明顯高于健康體檢者(P ＜0.05，見表1)。

表1 兩組T 細(xì)胞亞群分布比較(s)Tab 1 Comparison of T cells distribution between two groups (s)

表1 兩組T 細(xì)胞亞群分布比較(s)Tab 1 Comparison of T cells distribution between two groups (s)

組別 CD3 +(%) CD4 +(%) CD8 +(%) CD4 + /CD8+健康體檢者 77.95 ±10.45 45.34 ±7.10 25.44 ±6.17 1.93 ±0.56 CHC 患者 76.45 ±9.43 41.17 ±5.41 31.45 ±9.02 1.62 ±0.88 P 值0.432 0.001 0.000 0.012

2.2 HCV RNA 載量與T 細(xì)胞亞群分布的相關(guān)性分析 CD3+T 細(xì)胞亞群百分率與HCV 復(fù)制程度之間無明顯相關(guān)性(r=0.025，P =0.421);CD4+T 細(xì)胞亞群百分率與HCV 復(fù)制程度之間有明顯相關(guān)性(r =0.783，P=0.002)，隨著HCV 復(fù)制程度增加，CD4+T細(xì)胞亞群百分率逐漸降低;CD8+T 細(xì)胞亞群百分率與HCV 復(fù)制程度之間有明顯相關(guān)性(r = 0. 942，P =0.000)，隨著HCV 復(fù)制程度增加，CD8+T 細(xì)胞亞群百分率逐漸升高;CD4+/CD8+比值與HCV 復(fù)制程度之間有明顯相關(guān)性(r =0.682，P =0.005)，隨著HCV 復(fù)制程度增加，其比值逐漸降低(見表2)。

表2 不同HCV RNA 載量人群T 細(xì)胞亞群分布(s)Tab 2 T cell subsets distribution of different HCV RNA load crowd (s)

表2 不同HCV RNA 載量人群T 細(xì)胞亞群分布(s)Tab 2 T cell subsets distribution of different HCV RNA load crowd (s)

組別 例數(shù) CD3 +(%) CD4 +(%) CD8 +(%) CD4 + /CD8+51中載量組 22 75.89 ±4.24 42.22 ±6.24 31.46 ±5.76 1.32 ±0.18低載量組 23 77.01 ±9.31 43.28 ±4.07 27.34 ±4.99 1.64 ±0.27健康體檢組 20 77.95 ±10.45 45.34 ±7.10 25.44 ±6.17 1.93 ±0.56 r 值高載量組 20 76.04 ±8.02 38.02 ±5.92 38.93 ±3.66 1.04 ±0.0.025 0.783 0.942 0.682 P 值0.421 0.002 0.000 0.005

3 討論

HCV 感染能引起慢性病毒性肝炎、腫硬化、肝細(xì)胞癌，嚴(yán)重影響感染者的生活質(zhì)量和身體健康。HCV主要由血液/體液傳播，隨著檢測技術(shù)的不斷進(jìn)步，自然人群、獻(xiàn)血者HCV 陽性檢出率呈升高趨勢，可能與血制品的廣泛應(yīng)用、器官移植的興起和人們生活方式的改變等因素相關(guān)［6］。調(diào)查顯示，全球有1.7 億人感染HCV，我國普通人群抗HCV 陽性率為3. 2%［5］。HCV 感染引起脂肪肝與病毒感染、肥胖、高脂血癥等因素密切相關(guān)。其中HCV 感染引起的慢性肝炎主要引起膽管損傷、肝內(nèi)門靜脈旁淋巴細(xì)胞浸潤或淋巴濾泡聚集、肝細(xì)胞脂肪變性和壞死［7］。

細(xì)胞免疫作為人體免疫系統(tǒng)中的重要組成部分，通過調(diào)節(jié)T 淋巴細(xì)胞各亞群的比例維持人體免疫內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，越來越多的疾病被證實(shí)與T 淋巴細(xì)胞亞群的變化密切相關(guān)［8］。T 淋巴細(xì)胞的數(shù)量及比例在一定程度上反映了機(jī)體的免疫水平，機(jī)體正常免疫狀態(tài)下各T 淋巴細(xì)胞亞群之間相互協(xié)調(diào)制約，維持機(jī)體的正常免疫狀態(tài)，一旦T 淋巴細(xì)胞亞群的數(shù)量級比例發(fā)生變化，機(jī)體的免疫功能出現(xiàn)紊亂［9］。研究顯示，在HCV 的病理生理中，宿主細(xì)胞免疫應(yīng)答是決定病情發(fā)展的關(guān)鍵因素之一［10］。機(jī)體本身的代償能力使得HCV 感染并不能引起機(jī)體血清變化，HCV 感染造成的免疫功能紊亂才是造成肝損傷的直接因素。T 淋巴細(xì)胞各亞群各司其職，CD3+T 細(xì)胞和CD4+T 細(xì)胞的主要作用是輔助和誘導(dǎo)免疫應(yīng)答、活化巨噬細(xì)胞，同時還具有分泌淋巴因子、啟動遲發(fā)性超敏反應(yīng)的作用。除此之外，CD4+T 細(xì)胞還能促進(jìn)免疫細(xì)胞的增殖及分化，調(diào)節(jié)體液免疫和細(xì)胞免疫，維持機(jī)體的正常細(xì)胞免疫功能［5］。由于CHC 患者缺乏有效的中和抗體，所以機(jī)體的細(xì)胞免疫功能對清除體內(nèi)HCV 十分關(guān)鍵，但大多數(shù)CHC 患者的細(xì)胞免疫功能受到不同程度的損害。本研究顯示，CD3+T 細(xì)胞亞群在兩組人群中分布，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;CD4+T 細(xì)胞亞群和CD4+/CD8+在CHC 患者中分布明顯低于健康體檢者，CD8+T 細(xì)胞亞群在CHC 患者中分布明顯高于健康體檢者。因此，CHC 慢性化的主要原因可能是HCV 感染所致T 細(xì)胞各亞群的比例變化，提示細(xì)胞免疫可能是HCV 發(fā)病的主要機(jī)制。此外，不同HCV RNA載量與外周血T 淋巴細(xì)胞的相關(guān)性分析顯示，CD3+T細(xì)胞亞群百分率與HCV 復(fù)制程度之間無明顯相關(guān)性，CD4+T 細(xì)胞亞群、CD8+T 細(xì)胞亞群百分率和CD4+/CD8+比值與HCV 復(fù)制程度之間有明顯相關(guān)性，表明HCV 感染所致機(jī)體免疫功能的改變首先反映在CD4+/CD8+比值下降，CD4+/CD8+比值下降可能與HCV 存在和復(fù)制相關(guān)。

綜上所述，CHC 患者HCV 感染慢性化與外周血T淋巴細(xì)胞亞群比例之間存在密切相關(guān)性。HCV RNA復(fù)制程度增加進(jìn)一步導(dǎo)致T 細(xì)胞亞群的紊亂，CD4+/CD8+比值的動態(tài)變化可提示HCV 感染者細(xì)胞免疫功能的變化。

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