Zebularine 對肝癌HepG2 細(xì)胞凋亡的影響及其機制

丁佑銘，於展飛，廖曉峰

1.武漢大學(xué)人民醫(yī)院肝膽腹腔鏡外科，湖北 武漢430060;2.襄陽市中心醫(yī)院普外科

原發(fā)性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是高度惡性腫瘤，盡管其發(fā)病率在惡性腫瘤中僅排第5 位，但其死亡率高居第2 位。全球每年新增約75 萬病例，并有超過70 萬患者死亡［1］。研究發(fā)現(xiàn)，表觀遺傳學(xué)在腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸過程中扮演重要角色，其中DNA 甲基化是基因表達(dá)的遺傳學(xué)改變的主要方式之一［2］。研究發(fā)現(xiàn)，抑癌基因失活機制之一是啟動子CpG 高甲基化，因此，去甲基化藥物作為新的抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞分化的腫瘤治療方法具有廣闊的研究前景。Zebularine［1-(B-D-呋喃核糖苷)-1，2-二氫嘧啶-2-酮］作為新型DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase，DNMT)抑制劑，可抑制后者甲基化作用［3］。人類相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子3(human runt-related transcription factor 3，RUNX3)基因在肝癌、乳腺癌、胃癌、大腸癌及肺癌等多種腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)甚至缺失，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用［4-5］，研究發(fā)現(xiàn)，RUNX3 基因表達(dá)下調(diào)或缺失的主要機制是其基因啟動子甲基化［6-7］。本研究以人肝癌細(xì)胞系HepG2 細(xì)胞作為研究對象，觀察Zebularine 對肝癌細(xì)胞凋亡的影響，檢測其對細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Caspase3、Caspase9 表達(dá)的影響，并檢測其能否上調(diào)RUNX3 基因表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌細(xì)胞系HepG2 細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，由武漢大學(xué)中心實驗室凍存;Zebularine、MTT、DMSO、羅 丹 明 123 (Rhodamine 123，Rho123)購自Sigma 公司;胎牛血清購自Invitrogen 公司;RPMI 1640 培養(yǎng)液購自杭州四季青生物材料研究所;AnnexinV/PI 試劑盒購自BENDER 公司;Bcl-2、Bax、Pro-Caspase-3、Pro-Caspase-9、Cleaved-Caspase-3、Cleaved-Caspase-9 及RUNX3 單克隆抗體購自Cell Signaling Technology 公司;辣根酶標(biāo)記兔抗山羊IgG 或兔抗山羊IgG 購自武漢博士德生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):HepG2 細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI 1640 培養(yǎng)液中(含10%小牛血清，100 U/ml 青霉素，100 μg/ml鏈霉素)，置于37 ℃，飽和濕度，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每次均取生長狀態(tài)良好的并處于對數(shù)期的細(xì)胞進行實驗。

1.2.2 MTT 法檢測細(xì)胞增殖抑制率:取對數(shù)生長期的細(xì)胞配制成1.5 ×104個/ml 的細(xì)胞混懸液，將混懸液按每孔100 μl 加入96 孔培養(yǎng)板，并在周圍孔內(nèi)加入高壓消毒的PBS 溶液，在孵箱中孵育培養(yǎng)約24 h 后取出，棄上清，換Zebularine 終濃度為0、100、200、400 μmol/L 的培養(yǎng)液，每組設(shè)置5 個復(fù)孔，同時設(shè)立調(diào)零孔，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h，于每次實驗結(jié)束前4 h 棄孔內(nèi)液體，每孔加入20 μl MTT 溶液(濃度為0.5 mg/ml)，培養(yǎng)4 h，棄孔內(nèi)液，加150 μl DMSO，置于搖床上振蕩10 min 后在酶標(biāo)儀上檢測490 nm 處的吸光值(A值)，抑制率(%)=［1 -(實驗組平均A 值-調(diào)零孔A值)/(對照組平均A 值-調(diào)零孔A 值)］×100%。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡:將對數(shù)生長期的細(xì)胞配制成1 ×106個/ml 的細(xì)胞混懸液，將懸液接種于6 孔板中，在孵箱中孵育培養(yǎng)約24 h 后取出，棄上清。換含Zebularine 終濃度為0、100、200、400 μmol/L 的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后，收集細(xì)胞，預(yù)冷PBS 洗滌細(xì)胞2 次，并將細(xì)胞重懸于Binding Buffer 中。加入5 μl Annexin V-FITC 室溫、避光反應(yīng)10 min，加入5 μl PI混勻，室溫、避光反應(yīng)15 min。篩網(wǎng)過濾后，上機檢測細(xì)胞凋亡率。

1.2.4 Rho123 染色流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞線粒體膜電位水平:細(xì)胞接種及分組同上，培養(yǎng)48 h 后，收集細(xì)胞，PBS 漂洗3 次，將細(xì)胞重懸于1 ml 的Rho123(1 μg/ml)中，放置培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育30 min。PBS 洗滌3 次，用EPICS-XL 型流式細(xì)胞儀以507 nm 為激發(fā)波長，529 nm 為發(fā)射波長測定細(xì)胞內(nèi)熒光強度。

1.2. 5 Western blotting 檢測Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9 及RUNX3 蛋白表達(dá)變化:細(xì)胞接種及分組同上，培養(yǎng)48 h 后，收集細(xì)胞，加入100 μl 裂解液+1.742 μl PMSF 蛋白酶抑制劑重懸細(xì)胞，用移液器吹打細(xì)胞置混勻，使裂解液和細(xì)胞充分接觸。置于冰上裂解約45 min。后12 000 r/min(離心半行5 cm)，4℃離心30 min，后吸取上清，將樣品分裝至預(yù)冷的EP管中，-80 ℃保存。BCA 法測定蛋白質(zhì)濃度，加入1/5體積的5 ×上樣緩沖液至提取的細(xì)胞蛋白樣品中，沸水煮沸5 min，-20 ℃保存。將細(xì)胞蛋白樣品行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(上樣量20 μg/孔)，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜，再加入5%脫脂奶粉，室溫封閉1 h，分別加入1 ∶1 000 稀釋的兔抗或鼠抗人Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9 及RUNX3 抗體，4 ℃過夜，β-actin作為內(nèi)參，第2 天TBST 洗膜后，根據(jù)一抗來源不同分別加入1∶1 000 稀釋的辣根酶標(biāo)記的山羊抗或山羊抗鼠二抗，室溫放置2 h，再次TBST 洗膜后加入ECL 發(fā)光液顯色，暗室內(nèi)顯影并觀察各條帶深淺變化。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以s 表示，兩樣本間參數(shù)比較采用獨立樣本t 檢驗，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Zebularine 對HepG2 細(xì)胞增殖的影響 MTT 法檢測顯示，Zebularine 能顯著抑制HepG2 細(xì)胞增殖，Zebularine 對HepG2 細(xì)胞的增殖抑制作用呈時間和濃度依賴性，藥物濃度越高、作用時間越長，其發(fā)揮抗腫瘤作用效果也越好(見圖1)。

2.2 Zebularine 對HepG2 細(xì)胞凋亡的影響 HepG2細(xì)胞經(jīng)Zebularine 處理48 h 后，流式細(xì)胞儀凋亡檢測結(jié)果顯示，Zebularine 組的細(xì)胞凋亡率從12.4%增加35.4%，而凋亡率僅為3.3%(見圖2)。

2.3 Zebularine 對HepG2 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9 表達(dá)的影響 Zebularine 處理HepG2 細(xì)胞48 h 后結(jié)果顯示，隨著Zebularine 濃度的升高，Bax 蛋白表達(dá)量也逐漸升高，而Bcl-2 蛋白表達(dá)量逐漸降低，Pro-Caspase-3、Pro-Caspase-9 表達(dá)減弱，而Cleaved-Caspase-3、Cleaved-Caspase-9 表達(dá)增強，呈濃度依賴性(見圖3)。

圖1 Zebularine 對HepG2 細(xì)胞抑制率的影響Fig 1 Effect of Zebularin on cell inhibition ratio in HepG2 cells

圖2 Zebularine 對HepG2 細(xì)胞凋亡率的影響 A:0 μmol/L;B:100 μmol/L;C:200 μmol/L;D:400 μmol/LFig 2 Effect of Zebularine on cell apoptosis in HepG2 cells A:0 μmol/L;B:100 μmol/L;C:200 μmol/L;D:400 μmol/L

圖3 Zebularine 對HepG2 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9 表達(dá)的影響Fig 3 Effect of Zebularine on the expression of Bcl-2，Bax，Caspase-3 and Caspase-9 in HepG2 cells

2.4 Zebularine 對HepG2 細(xì)胞線粒體膜電位的影響Zebularine(0、100、200、400 μmol/L)處理48 h 后，HepG2 細(xì)胞線粒體熒光強度隨著藥物濃度的升高逐漸降低(P ＜0.05)。

2.5 Zebularine 對HepG2 細(xì)胞RUNX-3 蛋白表達(dá)的影響 Zebularine 處理HepG2 細(xì)胞48 h 后，Western blotting 檢測結(jié)果顯示，隨著藥物濃度的逐漸升高，抑癌基因RUNX3 表達(dá)逐漸增加(見圖4)。

圖4 Zebularine 對HepG2 細(xì)胞RUNX3 表達(dá)的影響Fig 4 Effect of Zebularine on the expression of RUNX3 in HepG2 cells

3 討論

國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄生長因子β(transforming growth factor，TGF-β)信號通路在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要意義［8-9］。RUNX3 參與了TGF-β 信號通路誘導(dǎo)生長抑制的過程［10］。研究證實，RUNX3 基因在多種腫瘤如乳腺癌、胃癌、大腸癌、肝癌及肺癌等腫瘤中表達(dá)下調(diào)、缺失，導(dǎo)致TGF-β 信號途徑紊亂，引起TGF-β 信號失活，進而引發(fā)細(xì)胞凋亡障礙，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，并在腫瘤發(fā)展過程中起重要作用［4-5］。CpG區(qū)異常高甲基化是除突變和缺失外腫瘤抑癌基因表達(dá)下調(diào)或沉默的機制，繼而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄停止，RUNX3 失活，與細(xì)胞增殖、凋亡、分化、惡性轉(zhuǎn)化密切相關(guān)［11］。有證據(jù)表明，恢復(fù)RUNX3 基因的表達(dá)能抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期并抑制細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移［12］。

由于DNA 甲基化在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸過程中扮演重要角色，且其甲基化改變是可逆的，因此，DNA甲基化可能成為藥物治療的理想靶點。Zebularine 是新型DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase，DNMT)抑制劑，能抑制DNMT 甲基化作用。研究發(fā)現(xiàn)，Zebularine 能使卵巢癌細(xì)胞中因啟動子CpG 高甲基化而表達(dá)低下或沉默的RASSF1A 及Hmlh1 基因表達(dá)上調(diào)［13-14］。本實驗發(fā)現(xiàn)，Zebularine 處理HepG2 細(xì)胞48 h 后，RUNX3 蛋白表達(dá)上調(diào)，且呈濃度依賴性。MTT法檢測結(jié)果顯示，Zebularine 對HepG2 細(xì)胞的增殖抑制作用呈時間和濃度依賴性，藥物濃度越高、作用時間越長，其發(fā)揮抗腫瘤作用效果越好。流式細(xì)胞儀檢測Zebularine 處理HepG2 細(xì)胞后可檢測到明顯凋亡，提示Zebularine 抑制HepG2 細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡的作用與其上調(diào)RUNX3 表達(dá)可能有關(guān)。

本研究進一步探討了Zebularine 對細(xì)胞凋亡線粒體途徑的影響，Zebularine 處理48 h 后，Western blotting 檢測結(jié)果顯示HepG2 細(xì)胞的Bcl-2 表達(dá)下調(diào)，Bax表達(dá)上調(diào)，Pro-Caspase-3、Pro-Caspase-9 表達(dá)減弱，而Cleaved-Caspase-3、Cleaved-Caspase-9 表達(dá)增強，且呈劑量依賴性。此外，Zebularine 能降低HepG2 細(xì)胞線粒體膜電位，表明Zebularine 可通過線粒體途徑促進細(xì)胞凋亡。Bcl-2 是一種內(nèi)膜蛋白，是公認(rèn)的強效凋亡抑制分子，其主要是通過增強線粒體膜電位、保持線粒體內(nèi)外膜的完整性、抑制鈣離子釋放、阻止核酸內(nèi)切酶活化等機制發(fā)揮凋亡抑制作用［15-16］;Bax 也屬于Bcl-2家族成員，但其與Bcl-2 作用相反，Bax 可直接激活死亡效應(yīng)因子Caspase 或改變細(xì)胞膜通透性引起細(xì)胞色素C 釋放某些離子和小分子通過細(xì)胞膜，進而促進細(xì)胞凋亡。Caspase 是引起凋亡的直接效應(yīng)物。Caspase-9 是線粒體凋亡途徑的關(guān)鍵蛋白酶，處于Caspase“瀑布式”激活的頂端，其活化對線粒體凋亡通路具有重要意義，并進一步激活細(xì)胞凋亡的執(zhí)行器Caspase-3，后者活化后可通過裂解DNA 修復(fù)相關(guān)分子、凋亡抑制蛋白、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白和骨架蛋白等多種機制，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

綜上所述，本研究認(rèn)為，在肝癌細(xì)胞中，抑癌基因RUNX3 由于啟動子甲基化而失活，Zebularine 能逆轉(zhuǎn)RUNX3 甲基化狀態(tài)，恢復(fù)RUNX3 表達(dá)，從而抑制細(xì)胞增殖，并通過細(xì)胞凋亡線粒體途徑促進細(xì)胞凋亡。

［1］ Jemal A，Bray F，Center MM，et al. Global cancer statistics［J］. CA Cancer J Clin，2011，61(2):69-90.

［2］ Shenker N，F(xiàn)lanagan JM. Intragenic DNA methylation:implications of this epigenetic mechanism for cancer research ［J］. Br J Cancer，2012，106(2):248-253.

［3］ Yoo CB，Cheng JC，Jones PA. Zebularine:a new drug for epigenetic therapy［J］. Biochem Soc Trans，2004，32(Pt 6):910-912.

［4］ Jeong P，Min BD，Ha YS，et al. RUNX3 methylation in normal surrounding urothelium of patients with non-muscle-invasive bladder cancer:potential role in the prediction of tumor progression［J］. Eur J Surg Oncol，2012，38(11):1095-1100.

［5］ Shiraha H，Nishina S，Yamamoto K. Loss of runt-related transcription factor 3 causes development and progression of hepatocellular carcinoma［J］.J Cell Biochem，2011，112(3):745-749.

［6］ Lee CW，Ito K，Ito Y. Role of RUNX3 in bone morphogenetic protein signaling in colorectal cancer［J］. Cancer Res，2010，70(10):4243-4252.

［7］ Kodach LL，Jacobs RJ，Heijmans J，et al. The role of EZH2 and DNA methylation in the silencing of the tumor suppressor RUNX3 in colorectal cancer［J］. Carcinogenesis，2010，31(9):1567-1575.

［8］ Calone I，Souchelnytskyi S. Inhibition of TGFβ signaling and its implications in anticancer treatments ［J］. Exp Oncol，2012，34(1):9-16.

［9］ Liu LC，Tsao TC，Hsu SR，et al. EGCG inhibits transforming growth factor-β-mediated epithelial-to-mesenchymal transition via the inhibition of Smad2 and Erk1/2 signaling pathways in nonsmall cell lung cancer cells［J］. J Agric Food Chem，2012，60(39):9863-9873.

［10］ Watanabe K，Sugai M，Nambu Y，et al. Requirement for Runx proteins in IgA class switching acting downstream of TGF-beta 1 and retinoic acid signaling［J］. J Immunol，2010，184(6):2785-2792.

［11］ Ku JL，Kang SB，Shin YK，et al. Promoter hypermethylation downregulates RUNX3 gene expression in colorectal cancer cell lines［J］.Oncogene，2004，23(40):6736-6742.

［12］ Chi XZ，Yang JO，Lee KY，et al. RUNX3 suppresses gastric epithelial cell growth by inducing p21 (WAF1/Cip1)expression in cooperation with transforming growth factor {beta}-activated SMAD ［J］.Mol Cell Biol，2005，25(18):8097-8107.

［13］ Shen WJ，Liu SL，Qiu GR. Zebularine regulates reexpression of RASSF1A gene in human ovarian cancer cell A2780［J］. J Southeast Univ (Med Sci Edi)，2011，30(4):550-554.沈文靜，劉石磊，邱廣蓉. Zebularine 調(diào)控卵巢癌A2780 細(xì)胞RASSF1A 基因再表達(dá)的研究［J］. 東南大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2011，30(4):550-554.

［14］ Liu SL，Shen WJ，Qiu GR. Zebularine induces demethylation and reexpression of hMLH1 Gene in human ovarian cancer cell line［J］.Journal of China Medical University，2011，40(7):597-599，604.劉石磊，沈文靜，邱廣蓉. Zebularine 調(diào)控卵巢癌細(xì)胞hMLH1 基因再表達(dá)［J］. 中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2011，40(7):597-599，604.

［15］ Gogada R，Prabhu V，Amadori M，et al. Resveratrol induces p53-independent，X-linked inhibitor of apoptosis protein (XIAP)-mediated Bax protein oligomerization on mitochondria to initiate cytochrome c release and caspase activation［J］. J Biol Chem，2011，286(33):28749-28760.

［16］ Pucci B，Bertani F，Karpinich NO，et al. Detailing the role of Bax translocation，cytochrome c release，and perinuclear clustering of the mitochondria in the killing of HeLa cells by TNF［J］. J Cell Physiol，2008，217(2):442-449.