PEG10 基因?qū)AK 介導(dǎo)的肝癌CAM-DR 耐藥模型中PI3K/Akt 通路的影響

張 海，朱燕莉，常 城，李 丹，張 麗，余力群，方春華，胡亞華

湖北理工學(xué)院附屬醫(yī)院 黃石市中心醫(yī)院消化內(nèi)科，湖北 黃石435000

原發(fā)性肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一種全球高度惡性腫瘤，發(fā)病率在惡性腫瘤中位居第5 位［1］。由于HCC 起病隱匿，極易經(jīng)門靜脈系統(tǒng)形成肝內(nèi)播散及肝外轉(zhuǎn)移，預(yù)后極差?；熥鳛楦伟┑妮o助治療在預(yù)防其復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著不可替代的作用，而化療藥物治療進(jìn)展較緩慢，其主要原因是HCC對多種化療藥均具有廣泛的耐藥性，導(dǎo)致其產(chǎn)生耐藥現(xiàn)象的生物學(xué)基礎(chǔ)是多藥耐藥及相關(guān)基因異常表達(dá)，但它們在正常細(xì)胞及組織中均有表達(dá)，缺乏特異性。因此尋找參與肝癌侵襲、轉(zhuǎn)移和化療耐藥的特異性干預(yù)靶點(diǎn)并闡明其機(jī)制十分重要。PEG10(paternal expressed gene 10)是2001 年發(fā)現(xiàn)的一種新的遺傳印記基因，近期研究［2］表明該基因不僅在肝癌組織和再生正常肝臟組織中高表達(dá)，而且能夠促進(jìn)正常人肝細(xì)胞增殖，并發(fā)現(xiàn)PEG10 基因與肝癌侵襲、轉(zhuǎn)移和化療耐藥密切相關(guān)，但相關(guān)的機(jī)制研究尚未見報道。本課題利用實(shí)驗(yàn)室穩(wěn)定表達(dá)PEG10 基因的LO2 細(xì)胞株建立肝癌CAM-DR 模型，探討其對順鉑(DDP)、5-氟尿嘧啶(5-Fu)、阿霉素(ADM)等化療藥物的耐藥性以及對FAK 介導(dǎo)的PI3K/Akt 通路的影響

1 材料與方法

1.1 材料 穩(wěn)定表達(dá)PEG10 基因的LO2 細(xì)胞株;RPMI 1640 培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自美國Hyclone 公司;PBS 購自北京中杉生物技術(shù)有限公司;MTT 購自美國Sigma 公司;DDP，凍干型(山東齊魯制藥廠;批號:6040122DC);FAK 蛋白抑制劑(PF-562271;Selleck Chemicals，美國);纖維連接蛋白(FN)(Bedford，MA)，用雙蒸水溶解至1 mg/ml，20 ℃存儲，每次實(shí)驗(yàn)前用PBS 稀釋至20 μg/ml?？贵w:PI3K mouse monoclonal antibody，Akt mouse monoclonal antibody，p-Akt rabbit monoclonal antibody 均購自Cruz Biotechnology (Santa Cruz，CA，USA). β-actin (Sigma，St Louis，MO，USA);ECL 發(fā)光試劑盒購自Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 LO2 細(xì)胞:常規(guī)復(fù)蘇正常肝細(xì)胞LO2 細(xì)胞，按貼壁方法培養(yǎng)，從液氮中取出凍存的細(xì)胞在37 ℃水浴中快速融化，加入含10%FBS RPMI 1640 新鮮培養(yǎng)基混合后1 800 r/min，離心5 min，除去上清液，用培養(yǎng)液混勻后，接種至培養(yǎng)瓶，置于CO2孵箱，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，細(xì)胞生長至近融合狀態(tài)時，用0.25%胰酶消化傳代，每周1 ～2 次。

1.2.2 LO2/CAM-DR 細(xì)胞模型的建立:用PBS 稀釋細(xì)胞外基質(zhì)成分FN 至20 μg/ml，100 μl/孔加入96 孔板后置于4 ℃過夜，第2 天吸出培養(yǎng)板中殘余液體，用PBS 洗滌3 次，每孔加入1% BSA 50 μl，置于37 ℃30 min 后接種細(xì)胞，即為LO2/CAM-DR 細(xì)胞模型。

1.2.3 化療藥物DDP、5-Fu、CADM 對LO2/CAM-DR和LO2 細(xì)胞的增殖影響:取對數(shù)生長期LO2 細(xì)胞，消化收集并調(diào)整為4 ×104/ml 的細(xì)胞懸液，接種到未處理(LO2 組)和已經(jīng)用FN 處理(LO2/CAM-DR 組)的96 孔板中，每板設(shè)置正常組、藥物組和FAK 抑制劑組(5 μmol/L)。培養(yǎng)過夜后，鏡下觀察確認(rèn)細(xì)胞貼壁良好。根據(jù)化療藥物血漿峰濃度，分別加入用培養(yǎng)基稀釋的藥物100 μl，使其中濃度分別為1、5、10、15、20 μg/ml，設(shè)3 個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h 后，每孔加入5 mg/ml的MTT 溶液20 μl，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔加入DMSO 150 μl，振蕩20 min，混勻。490 nm 波長下用多功能酶標(biāo)儀檢測每孔光密度值(OD 值)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。等體積的PBS 為空白對照組。按照下列公式計算:

存活率(%)= 藥物組OD 值/正常組OD 值×100%。以藥物濃度為橫坐標(biāo)，存活率為縱坐標(biāo)繪制濃度效應(yīng)曲線。以濃度-存活率曲線求出回歸方程，得出抑制50%細(xì)胞生長的濃度(IC50)，并計算耐藥倍數(shù)(resistance index，RI)，RI = 耐藥細(xì)胞IC50/親本細(xì)胞IC50。

1.2.4 Western blotting 法檢測PI3K、AKT 蛋白的表達(dá)水平:細(xì)胞的藥物處理按照1.2.3 所述，藥物作用24 h，收集總蛋白，并采用Bradford 法對總蛋白進(jìn)行定量檢測。將處理好的蛋白加入上樣緩沖液于沸水中煮沸5 min 后即可進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，并進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，以及ECL 發(fā)光試劑盒顯影。

1.2. 5 RT-PCR 法檢測PI3K mRNA 的含量:根據(jù)RNA 提取分離試劑盒(GE Healthcare，USA)提取細(xì)胞RNA。1 μg 總RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用OligodT引物和上標(biāo)放大系統(tǒng)。使用SYBR Green PCR Master Mix (Life Technologies)進(jìn)行定量RT-PCR。PI3K、AKT和GAPDH 的引物如下:PI3K:F:5＇-TAATGCGACAGGAGATAGG-3＇，R:5＇-TGCCATTGACTGAAAGAAC-3＇;GAPDH:F:5＇-ACCCACTCCTCCACCTTTGA-3＇，R:5＇-CTGTTGCTGTAGCCAAATTCGT-3＇。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用統(tǒng)計軟件SPSS 17.0 進(jìn)行統(tǒng)計，各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)組均重復(fù)3 次后統(tǒng)計結(jié)果，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用s 表示，級間比較采用t 檢驗(yàn)。P ＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，P ＜0.01 為差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 藥物敏感性實(shí)驗(yàn)

2.1. 1 MTT 檢測結(jié)果:不同濃度的DDP、5-FU 和ADM 作用LO2 細(xì)胞和LO2/CAM-DR 細(xì)胞24 h 后，細(xì)胞的存活率均下降，且與藥物濃度呈負(fù)相關(guān);在各濃度點(diǎn)LO2 細(xì)胞的存活率低于LO2/CAM-DR 細(xì)胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05，見圖1)。但在給藥前1 h 用5 mmol/L FAK 抑制劑處理LO2/CAM-DR 細(xì)胞后，細(xì)胞的存活率下降，與LO2/CAM-DR 細(xì)胞組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05，見圖1)。

2.1.2 IC50和RI 檢測結(jié)果:采用濃度-存活率曲線回歸方程計算出IC50和RI，DDP、5-FU 和ADM 的RI 分別為1.345、2.551 和2.643。采用FAK 抑制劑預(yù)先干預(yù)的LO2/CAM-DR 細(xì)胞對藥物的敏感性高于LO2/CAM-DR細(xì)胞，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05，見表1)，與LO2細(xì)胞相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05，見表1)

圖1 MTT 法檢測藥物對LO2 細(xì)胞和LO2/CAM-DR 細(xì)胞的敏感性Fig 1 Drug sensitivity of LO2 cells and LO2/CAM-DR cells detected by MTT method

表1 藥物對LO2 細(xì)胞和LO2/CAM-DR 細(xì)胞的IC50和RI 的比較(s)Tab 1 Comparison of IC50 and RI of drugs on LO2 cells and LO2/CAM-DR cells(s)

表1 藥物對LO2 細(xì)胞和LO2/CAM-DR 細(xì)胞的IC50和RI 的比較(s)Tab 1 Comparison of IC50 and RI of drugs on LO2 cells and LO2/CAM-DR cells(s)

注:與LO2 細(xì)胞組比較，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與LO2/CAM-DR 細(xì)胞組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01;RI1:LO2/CAM-DR 細(xì)胞與LO2 細(xì)胞IC50的比較;RI2:FAK 抑制劑組與LO2 細(xì)胞IC50的比較。

IC50(μg/ml)RI1 RI2 ADM 3.72 ±1.01 9.83 ±1.23＊＊ 2.61 ±0.77##LO2 細(xì)胞組 LO2/CAM-DR 細(xì)胞組 FAK抑制劑組2.643 0.703 5-FU 2.65 ±0.34 6.75 ±0.76＊＊ 2.42 ±1.31## 2.551 0.915 DDP 4.75 ±0.77 6.39 ±1.31* 2.57 ±0.57* #1.345 0.541

2.2 Western blotting 法檢測PI3K、p-AKT 蛋白的表達(dá)水平 用5 μmol/L 的DDP、5-FU 和ADM 作用細(xì)胞24 h，Western blotting 法檢測發(fā)現(xiàn)，LO2/CAM-DR 細(xì)胞中PI3K 和p-AKT 蛋白的表達(dá)水平上調(diào)，與LO2 細(xì)胞組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05);但在給藥前加入FAK 抑制劑作用LO2/CAM-DR 細(xì)胞后，PI3K 和p-AKT 蛋白的表達(dá)水平變化不顯著，與LO2 細(xì)胞組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)，但與LO2/CAM-DR細(xì)胞組相比，明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05，見圖2 和表2)。

圖2 Western blotting 法檢測藥物對FAK 介導(dǎo)的PI3K 和p-AKT 蛋白表達(dá)水平的影響Fig 2 The levels of PI3K and p-AKT proteins mediated through FAK by Western blotting

2.3 RT-PCR 法檢測藥物作用細(xì)胞后PI3K mRNA的水平變化 5 μmol/L 的DDP、5-FU 和ADM 作用細(xì)胞24 h 后，LO2/CAM-DR 細(xì)胞組的PI3K mRNA 水平均增加，與LO2 細(xì)胞組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05);采用FAK 蛋白抑制劑作用后，LO2/CAM-DR細(xì)胞組的PI3K mRNA 水平均下降，與LO2 細(xì)胞組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05);與LO2/CAM-DR細(xì)胞組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05，見表3)。

表2 PI3K、p-AKT 蛋白表達(dá)灰度值比較(s)Tab 2 The expression of PI3K and p-AKT proteins gray value(s)

表2 PI3K、p-AKT 蛋白表達(dá)灰度值比較(s)Tab 2 The expression of PI3K and p-AKT proteins gray value(s)

注:與LO2 細(xì)胞組比較，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與LO2/CAM-DR 細(xì)胞組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01。

LO2 細(xì)胞組 LO2/CAM-DR 細(xì)胞組 FAK抑制劑組DDP PI3K/β-actin 0.103 ±0.004 0.919 ±0.018＊＊ 0.087 ±0.014##p-AKT/AKT 0.039 ±0.002 0.339 ±0.019＊＊ 0.098 ±0.011##5-FU PI3K/β-actin 0.436 ±0.054 0.546 ±0.015 0.498 ±0.025 p-AKT/AKT 0.187 ±0.014 0.303 ±0.032* 0.109 ±0.043#ADM PI3K/β-actin 0.115 ±0.017 0.778 ±0.091＊＊ 0.096 ±0.011##p-AKT/AKT 0.198 ±0.053 0.654 ±0.053＊＊ 0.115 ±0.034##

表3 RT-PCR 法檢測藥物作用細(xì)胞后PI3K mRNA 水平變化(s)Tab 3 RT-PCR method detected the level of PI3K mRNA(s)

表3 RT-PCR 法檢測藥物作用細(xì)胞后PI3K mRNA 水平變化(s)Tab 3 RT-PCR method detected the level of PI3K mRNA(s)

注:與LO2 細(xì)胞組比較，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與LO2/CAM-DR 細(xì)胞組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01。

LO2細(xì)胞組LO2/CAM-DR細(xì)胞組FAK抑制劑組DDP 0.117 ±0.014 0.799 ±0.118＊＊ 0.187 ±0.114##5-FU 0.378 ±0.134 0.556 ±0.115 0.389 ±0.125 ADM 0.225 ±0.117 0.875 ±0.111＊＊ 0.196 ±0.111##

3 討論

HCC 已被認(rèn)為是最常見的惡性腫瘤之一，具有較高的死亡率，其主要治療障礙是多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)，包括內(nèi)源性和獲得性耐藥［3］。經(jīng)典的獲得性耐藥機(jī)制有4 點(diǎn):(1)藥物積累減少;(2)藥物靶點(diǎn)改變;(3)藥物誘導(dǎo)損傷的修復(fù)作用增強(qiáng);(4)抑制凋亡信號通路［4］。然而，由于腫瘤細(xì)胞和微環(huán)境之間的相互作用引起內(nèi)源性或新的耐藥性，可以產(chǎn)生對化療和死亡受體介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的抑制。有研究表明，腫瘤微環(huán)境對腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、侵襲具有重要作用［5］，并具有抗凋亡作用。在實(shí)體腫瘤中微環(huán)境元素包括細(xì)胞因子、激素以及腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)分子之間的相互作用，具有功能性特征。更重要的是，它們已經(jīng)被認(rèn)為是腫瘤微環(huán)境參與介導(dǎo)新的耐藥作用的基礎(chǔ)，該類型被命名為環(huán)境介導(dǎo)耐藥(environment mediated-drug resistance，EM-DR)，對細(xì)胞黏附介導(dǎo)耐藥(cell adhesion mediated-drug resistance，CAM-DR)和可溶性因子介導(dǎo)耐藥(soluble factormediated-drug resistance，SM-DR)有促進(jìn)作用［6］。目前，CAM-DR 最常用的模型是球體模型、纖維連接蛋白模型(FN)和基質(zhì)模型。本研究采用FN 黏附模型進(jìn)行研究。

活化的FAK 可以召集其他信號分子如SRC 和p85 亞基磷脂酰肌醇3 激酶(PI3K)黏附，從而激活下游細(xì)胞的生存信號，如通過PI3K/Akt 途徑［7］和胞外信號相關(guān)激酶(ERK)途徑［8］。整合素/FAK/SRC 信號可以刺激PI3K/Akt 和MEK/ERK 信號通路，是單獨(dú)還是組合使用，這取決于細(xì)胞的類型。FAK 抑制劑單獨(dú)使用可能不足以有效地針對性治療［9］。通過抑制功能平行或同一信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路FAK 和EGFR、FAK 和c-Met、FAK 和SRC 可以使凋亡細(xì)胞大幅死亡。此外，對化療藥物或FAK 抑制劑耐藥的癌細(xì)胞對化療藥物聯(lián)合FAK 抑制敏感。FAK 是一個潛在的代償基因富含脯氨酸的酪氨酸激酶(PYK2)，PYK2 與FAK 的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)具有很高的相似性，序列同源性，磷酸化位點(diǎn)，被整合素激活，并與其他的黏附蛋白有關(guān)［10］。通過封鎖預(yù)期冗余的基因和信號通路可能是必要的有效靶向治療。本研究結(jié)果也表明，LO2 細(xì)胞對化療藥物DDP、5-FU 和ADM 的敏感性顯著高于LO2/CAM-DR 細(xì)胞模型，但采用FAK 抑制劑預(yù)先作用后，LO2/CAM-DR 細(xì)胞對化療藥物DDP、5-FU 和ADM 的敏感性又恢復(fù)到LO2 細(xì)胞相當(dāng)?shù)乃?，這說明FAK 抑制劑與化療藥物聯(lián)合使用可能促進(jìn)藥物對細(xì)胞的敏感性，也可以促進(jìn)化療藥物對細(xì)胞黏附介導(dǎo)耐藥細(xì)胞的殺傷作用。

進(jìn)一步的機(jī)制研究也表明，通過FAK 抑制劑的預(yù)先作用，LO2/CAM-DR 細(xì)胞中PI3K 蛋白的表達(dá)水平和PI3K mRNA 水平下降，且進(jìn)一步下調(diào)了AKT 的磷酸化，從而促進(jìn)化療藥物對耐藥細(xì)胞的殺傷作用。

綜上所述，在PEG10 基因穩(wěn)定表達(dá)的LO2 細(xì)胞中，通過抑制FAK 蛋白的表達(dá)，可以下調(diào)PI3K/Akt 信號通路，進(jìn)而促進(jìn)耐藥細(xì)胞對化療藥物的敏感性。因此，通過化療藥物與FAK 抑制劑的聯(lián)合使用，可以提高化療藥物對肝癌耐藥細(xì)胞的殺傷作用，下調(diào)FAK 介導(dǎo)的肝癌CAM-DR 耐藥模型中PI3K/Akt 通路。

［1］ Wang XM，Zheng ZL，Gao F，et al. Ultrasonic features of primary hepatocellular carcinoma with negative and positive expression of alpha fetoprotein:Comparison analysis［J］. Chin J Med Imaging Technol，2014，30(6):877-880.王曉嫚，鄭哲嵐，高楓，等. 甲胎蛋白陰性和陽性原發(fā)性肝細(xì)胞癌的超聲特征比較［J］. 中國醫(yī)學(xué)影像技術(shù)，2014，30(6):877-880.

［2］ Lin Y，Zhang YL，Hu X，et al. Molecular mechanism and function research of highly expressed PEG10 gene in hepatocellular carcinoma［J］.Tumor，2013，33(1):28-35.林昀，張云麗，胡昕，等. PEG10 基因在肝癌組織中高表達(dá)的分子機(jī)制及其功能的研究［J］. 腫瘤，2013，33(1):28-35.

［3］ Li Y，Dang GY. Clinical diagnosis of co-detection of serum CEA，CA-199 and CA-125 in primary hepatocellular carcinoma［J］. Journal of Clinical Experimental Medicine，2014，13(12):966-968.李瑩，黨國義.血清CEA、CA-199 和CA-125 檢測在原發(fā)性肝細(xì)胞癌診斷中的臨床價值［J］. 臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2014，13(12):966-968.

［4］ del Carmen MG，Birrer M，Schorge JO. Clear cell carcinoma of the ovary:a review of the literature［J］. Gynecol Oncol，2012，126(3):481-490.

［5］ Wei G，Margolin AA，Haery L，et al. Chemical genomics identifies small-molecule MCL1 repressors and BCL-xL as a predictor of MCL1 dependency［J］. Cancer Cell，2012，21(4):547-562.

［6］ Inuzuka H，Shaik S，Onoyama I，et al. SCF(FBW7)regulates cellular apoptosis by targeting MCL1 for ubiquitylation and destruction［J］.Nature，2011，471(7336):104-109.

［7］ Xia H，Nho RS，Kahm J，et al. Focal adhesion kinase is upstream of phosphatidylinositol 3-kinase/Akt in regulating fibroblast survival in response to contraction of type I collagen matrices via a beta 1 integrin viability signaling pathway［J］. J Biol Chem，2004，279(31):33024-33034.

［8］ Zhong X，Rescorla FJ. Cell surface adhesion molecules and adhesioninitiated signaling:understanding of anoikis resistance mechanisms and therapeutic opportunities ［J］. Cell Signal，2012，24 (2):393-401.

［9］ Bouchard V，Harnois C，Demers MJ，et al. B1integrin/Fak/Src signaling in intestinal epithelial crypt cell survival:integration of complex regulatory mechanisms［J］. Apoptosis，2008，13(4):531-542.

［10］ Brotin E，Meryet-Figuiere M，Simonin K，et al. Bcl-XL and MCL-1 constitute pertinent targets in ovarian carcinoma and their concomitant inhibition is sufficient to induce apoptosis［J］. Int J Cancer，2010，126(4):885-895.