補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化大鼠細(xì)胞間黏附分子-1表達(dá)的影響

補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化大鼠細(xì)胞間黏附分子-1 表達(dá)的影響

呂永恒黎洪展肖衛(wèi)輝吳曉偉陳鐵明

(南方醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，廣東廣州510315)

摘要〔〕目的研究補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化(AS)大鼠細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)表達(dá)的影響。方法采用高膽固醇飼料喂飼建立大鼠AS模型并予補(bǔ)陽(yáng)還五湯干預(yù)。測(cè)定各組內(nèi)膜增生情況，免疫組化觀察內(nèi)膜粥樣硬化斑塊中ICAM-1的表達(dá)。結(jié)果補(bǔ)陽(yáng)還五湯組內(nèi)膜增生較模型組明顯減輕(P<0.05)。補(bǔ)陽(yáng)還五湯組ICAM-1表達(dá)較模型組明顯減少(P=0.019)。結(jié)論補(bǔ)陽(yáng)還五湯能顯著改善大鼠AS水平；可明顯抑制ICAM-1表達(dá)，此可能為其防治AS的機(jī)制之一。

關(guān)鍵詞〔〕補(bǔ)陽(yáng)還五湯；動(dòng)脈粥樣硬化；細(xì)胞間黏附分子

中圖分類(lèi)號(hào)〔〕R285〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

基金項(xiàng)目：廣東省中醫(yī)藥局項(xiàng)目(No.20121122)

通訊作者：黎洪展(1973-)，男，副主任醫(yī)師，碩士，主要從事心腦血管疾病研究。

第一作者：呂永恒(1971-)，男，副主任醫(yī)師，碩士，主要從事心血管疾病研究。

研究認(rèn)為動(dòng)脈粥樣硬化(AS)過(guò)程不僅僅是脂質(zhì)在動(dòng)脈壁中的聚積，而且是一種慢性炎癥性疾病，多種炎性細(xì)胞因子的過(guò)度釋放是其重要機(jī)制〔1〕。已有研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)參與了AS的形成過(guò)程〔2〕?；钛⒁鏆?、化痰是中醫(yī)治療冠心病的常用方法，補(bǔ)陽(yáng)還五湯是收載于《醫(yī)林改錯(cuò)》中的經(jīng)典方劑，具有益氣活血、通經(jīng)活絡(luò)的功效，已有研究認(rèn)為補(bǔ)陽(yáng)還五湯具有抗AS作用〔3〕。本研究探討補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)試驗(yàn)性大鼠AS形成及主動(dòng)脈ICAM-1表達(dá)的影響。

1材料和方法

1.1 主要試劑和儀器ICAM-1單克隆抗體購(gòu)自武漢博士德生物工程公司；即用型SABC免疫組化試劑盒(含生物素標(biāo)記山羊抗兔/大鼠IgG二抗和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈霉菌卵白素工作液)和二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；荷蘭威圖全自動(dòng)生化分析儀；LeicaRM2125切片機(jī)和LeicaDME321058943PX顯微攝像機(jī)由德國(guó)徠卡公司生產(chǎn)；OLYMPUSCH20BIMF200-2顯微鏡由日本奧林巴斯公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 藥物制備補(bǔ)陽(yáng)還五湯依原方組成，其中黃芪120 g，川芎15 g，當(dāng)歸15 g，赤芍15 g，桃仁12 g，紅花12 g，地龍10 g。將上述藥物用水煎煮3次，時(shí)間分別為1.5 h、1 h和45 min。合并煎煮液后濃縮成含生藥相當(dāng)于2.5 g/ml，分裝，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 動(dòng)物分組及給藥健康SD雄性大鼠30只，體質(zhì)量(280±20)g。將大鼠隨機(jī)分為三組：對(duì)照組、模型組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯組，每組10只。大鼠分組后，對(duì)照組為普通飲食；模型組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯組飼以高脂飲食參照文獻(xiàn)方法造模，其飼料配制是：4%膽固醇、10%豬油、0.2%甲基硫氧嘧啶、86%基礎(chǔ)飼料，基礎(chǔ)飼料中面粉20%，米粉2%、玉米20%、麩皮25%、豆料20%、骨粉2%、魚(yú)粉2%；補(bǔ)陽(yáng)還五湯組同時(shí)予補(bǔ)陽(yáng)還五湯煎劑，其中第1～2周通過(guò)灌胃給藥，以后拌入正常飼料中，每鼠每天經(jīng)上午、下午兩次給藥，日總量相當(dāng)于含生藥5 g/kg(相當(dāng)于體重為70 kg的成人用量)12 w后實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 主動(dòng)脈病變病理檢查及主動(dòng)脈內(nèi)膜增生測(cè)定將胸主動(dòng)脈段血管標(biāo)本浸入4%多聚甲醛溶液中，固定48 h，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色，光鏡下觀察主動(dòng)脈病理形態(tài)學(xué)改變。每片隨機(jī)取3個(gè)視野，用MIASE醫(yī)學(xué)圖像分析管理系統(tǒng)測(cè)血管內(nèi)膜厚度、內(nèi)膜中膜厚度比及內(nèi)膜面積/(內(nèi)膜面積+中膜面積)比值即內(nèi)膜增生指數(shù)。

1.2.4 主動(dòng)脈ICAM-1免疫組織化學(xué)染色在胸主動(dòng)脈中段定位切取2 mm×5 mm組織，制石蠟切片，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次，每次3 min，按免疫組化試劑盒說(shuō)明進(jìn)行免疫組化染色，在顯微鏡高倍視野下觀察分析陽(yáng)性結(jié)果，采用圖像分析系統(tǒng)，以陽(yáng)性表達(dá)的百分率半定量分析ICAM-1表達(dá)的強(qiáng)弱。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS10.0軟件行單因素方差分析。

2結(jié)果

2.1 主動(dòng)脈病理學(xué)改變?nèi)庋劭梢?jiàn)對(duì)照組內(nèi)膜光滑，無(wú)斑塊形成。高脂模型組血管表面不光滑，凹凸不平，大量黃白色斑塊突出于管腔表面，并連接成片，尤以近主動(dòng)脈弓處及血管開(kāi)口處最為明顯。HE 染色可見(jiàn)模型組的內(nèi)膜顯著增厚，內(nèi)膜不完整，內(nèi)皮下腔隙增大，內(nèi)含大量泡沫細(xì)胞，中彈力纖維增粗，彈力纖維和膠原纖維排列紊亂。補(bǔ)陽(yáng)還五湯組主動(dòng)脈內(nèi)膜厚度較模型組顯著變薄，病理改變減輕，只偶有少量的脂質(zhì)沉積、散在的泡沫細(xì)胞和炎癥細(xì)胞。與對(duì)照組相比，模型組管腔面積減小、新生內(nèi)膜面積增大、內(nèi)膜增生百分比增大(P<0.001)。與模型組相比，補(bǔ)陽(yáng)還五湯組管腔面積增大、新生內(nèi)膜面積減小、內(nèi)膜增生百分比減小(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 主動(dòng)脈ICAM-1免疫組化檢測(cè)ICAM-1在模型組的表達(dá)為(3.67±0.43)%，較對(duì)照組的(0.55±0.25)%明顯增高(F=15.34，P=0.002)，ICAM-1在補(bǔ)陽(yáng)還五湯組的表達(dá)為(1.29±0.52)%，較模型組降低(F=8.69，P=0.019)。見(jiàn)圖1。

表1　各組主動(dòng)脈內(nèi)膜增生情況比較 ± s, n=10)

1)模型組與對(duì)照組比較；2)模型組與補(bǔ)陽(yáng)還五湯組比較

圖1　各組大鼠主動(dòng)脈ICAM-1的表達(dá)(DAB，×200)

3討論

中醫(yī)研究認(rèn)為AS斑塊的形成與氣虛、血瘀、痰阻密切相關(guān)，有黏、濃、凝、聚的特點(diǎn)，以氣虛血瘀證型最為常見(jiàn)，益氣活血能明顯改善臨床癥狀，尤其可以改善高危人群的生活質(zhì)量，延長(zhǎng)生存期，降低致殘率和死亡率，因此活血化瘀一直是AS中醫(yī)藥防治研究的熱點(diǎn)。中醫(yī)學(xué)界AS的認(rèn)識(shí)與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的免疫炎癥機(jī)制有一定關(guān)聯(lián)，探討二者之間的內(nèi)在聯(lián)系，可以為中醫(yī)治療AS提供思路〔4，5〕。

本文用高脂高膽固醇飼養(yǎng)成功建立了動(dòng)脈粥樣硬化模型，其主要表現(xiàn)為血脂升高，大動(dòng)脈及冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮下脂質(zhì)浸潤(rùn)，管腔面積減小、新生內(nèi)膜面積增大、內(nèi)膜增生百分比增大等病理改變。加飼補(bǔ)陽(yáng)還五湯的動(dòng)物受累血管病變程度輕、管腔面積增大、新生內(nèi)膜面積減小、內(nèi)膜增生百分比減小，說(shuō)明具有補(bǔ)氣活血、通經(jīng)活絡(luò)功能的補(bǔ)陽(yáng)還五湯具有抗AS形成的作用。

ICAM-1屬于黏附分子免疫球蛋白超家族，廣泛分布在體內(nèi)的各種組織細(xì)胞的表面，其中以血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的表達(dá)最強(qiáng)。正常情況下內(nèi)皮細(xì)胞中的ICAM-1表達(dá)很低，在內(nèi)皮細(xì)胞缺血、再灌注損傷情況下，大量炎性遞質(zhì)、細(xì)胞因子等能誘導(dǎo)ICAM-1蛋白及mRNA 的表達(dá)，參與T細(xì)胞反應(yīng)、促進(jìn)單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附等。在動(dòng)脈粥樣硬化形成過(guò)程中，首先是血管內(nèi)皮受損，ICAM-1等表達(dá)增加，調(diào)節(jié)白細(xì)胞的黏附及穿越內(nèi)皮的游移，隨后單核細(xì)胞到內(nèi)皮下，攝取氧化修飾低密度脂蛋白，變?yōu)榧せ畹木奘杉?xì)胞，最終成為泡沫細(xì)胞〔6〕。ICAM-1在AS病人的脂紋和纖維斑塊中大量表達(dá)是AS早期的病理變化及斑塊進(jìn)展的潛在機(jī)制，并與AS的嚴(yán)重程度有關(guān)〔7〕，ICAM-1不僅有助于斑塊的形成，而且同斑塊的穩(wěn)定性有關(guān)〔8〕。抑制ICAM-1的表達(dá)，可以減輕或延緩AS病變的發(fā)生和發(fā)展〔9〕。本研究發(fā)現(xiàn)，AS模型組主動(dòng)脈可見(jiàn)大量ICAM-1陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞，并且主要表達(dá)于病變血管的內(nèi)皮及斑塊中，而補(bǔ)陽(yáng)還五湯能明顯抑制AS大鼠主動(dòng)脈ICAM-1的表達(dá)，從而抑制了AS時(shí)炎癥細(xì)胞趨化、黏附與遷移，抑制AS時(shí)局部炎癥反應(yīng)而達(dá)到防治AS的作用。

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〔2013-12-06修回〕

(編輯安冉冉/曹夢(mèng)園)