右歸丸及其拆方干預(yù)對老年腎陽虛證患者基因差異表達(dá)的影響

·基礎(chǔ)研究·

右歸丸及其拆方干預(yù)對老年腎陽虛證患者基因差異表達(dá)的影響

唐楊1，2項磊1周衛(wèi)東1孫曉敏劉艷艷3羅仁1趙曉山

(南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，廣東廣州510515)

摘要〔〕目的觀察右歸丸及其拆方對老年腎陽虛證患者基因差異表達(dá)的影響。方法選取年齡在60歲以上的腎陽虛證患者8例進(jìn)入研究，按隨機數(shù)字法將其分為兩組(右歸丸組及溫腎陽組各4例)，另將4例60歲以下健康人設(shè)為正常對照組。分別觀察治療前及療程結(jié)束后兩組臨床癥狀總積分，比較外周血白細(xì)胞的6條基因(SYPL1、PHF14、ARHGAP18、RECQL、OSTF1和SEC23B)的差異表達(dá)，并以GAPDH作為內(nèi)參對照。結(jié)果右歸丸組及溫腎陽組連續(xù)用藥2個療程后，癥狀總積分在治療前后均有統(tǒng)計學(xué)差異(t右歸丸=20.657，P<0.01，t溫腎陽=51.000，P<0.01)；治療后兩組間總積分比較有統(tǒng)計學(xué)差異(F=74.432，P<0.01)。RT-PCR結(jié)果顯示，SYPL1基因，在右歸丸組和溫腎陽組的表達(dá)水平均存在統(tǒng)計學(xué)差異(t左歸丸=-35.631，t溫腎陽=-13.000，P<0.01)，且治療后右歸丸組和溫腎陽組的表達(dá)均較治療前上升。治療后各組的SYPL1基因表達(dá)存在差異(F=487.049，P<0.01)，溫腎陽組表達(dá)上升程度不及右歸丸組。其他5種基因的表達(dá)情況與SYPL1基因狀況類似。結(jié)論(1)右歸丸及溫腎陽中藥復(fù)方對老年腎陽虛患者的基因差異表達(dá)均有改善作用，右歸丸優(yōu)于單純溫腎陽復(fù)方治療效果，驗證了陰中求陽法的優(yōu)越性。(2)老年腎陽虛患者的基因表達(dá)在短期內(nèi)不能單獨依靠藥物恢復(fù)至完全正常，需要一個長期和綜合的治療過程。

關(guān)鍵詞〔〕右歸丸；腎陽虛證

中圖分類號〔〕R2-03〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A〔

基金項目：國家自然科學(xué)基金(81173146，81202622)；NSFC-廣東聯(lián)合基金重點項目(No.U1132001)；廣東省科技廳與廣東省中醫(yī)藥科學(xué)院聯(lián)合基金資助項目(No.2011B032200004，2013A032500008)；廣東省科技計劃(No.2011B031700018)；廣州市科技計劃(2014Y2-00504)資助

通訊作者：趙曉山(1975-)，男，副主任醫(yī)師，研究員，主要從事常見慢性病的中西醫(yī)結(jié)合防治研究。

1南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院中醫(yī)科2贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院中醫(yī)科

3廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕科

羅仁(1952-)，男，博士生導(dǎo)師，教授，副主任醫(yī)師，主要從事腎病腎虛證的中醫(yī)藥防治研究。

第一作者：唐楊(1982-)，女，主治中醫(yī)師，在職博士，主要從事腎虛證的防治研究。

Significance of differential gene expression in kidney-yang deficiency syndrome treated by Yougui pill and its decomposed formula

TANG Yang, XIANG Lei, ZHOU Wei-Dong,etal.

School of Traditional Chinese Medicine, Southern Medical University, Guangzhou 510515,Guangdong, China

Abstract【】ObjectiveTo observe the differential gene expression in kidney-yang deficiency syndrome treated by Yougui pill.Methods8 patients above 60 years old with kidney-yang deficiency syndrome were included. The patients were randomly divided into Yougui pill treatment and nourishing Yang control group(n=4), another 4 healthy people under the age of 60 were set as normal control group. Each patient took the medicine for 4 weeks. The differential gene expressions for 6 genes(SYPL1,PHF14 ,ARHGAP18,RECQL,OSTF1 and SEC23B) pretherapy and post-treatment were observed respectively.ResultsAfter one course of treatment, the symptom integral had statistically significant difference within the treatment and control groups pretherapy and post-treatment(tt=20.657,P<0.01;tc=51.000，P<0.01),and the treatment group was superior to control groups in relieved the symptoms of kidney-yang deficiency syndrome(F=74.432，P<0.01); RT-PCR showed the difference of expression level of gene SYPL1 in Yougui pill group and nourishing Yang was statistically significant(P<0.01)pretherapy and post-treatment,both of the expressions of SYPL1 in two groups were increased than those of pretherapy.There were differences of gene expressions among every groups post-treatment(F=487.049,P<0.01). The other 5 genes' expressions were similar to that of SYPL1.ConclusionsThe gene expression in elderly patients with kidney-yang deficiency can not rely on medicaments to completely return to normal alone in the short term, which need a long-term and comprehensive treatment process.

【Key words】Yougui pill; Kidney-yang deficiency

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為人衰老與腎密切相關(guān)。腎陽為腎中精氣屬陽的部分，具有溫煦、升騰、推動、興奮和氣化等屬性。人體陽氣不足時，機體會出現(xiàn)畏寒肢冷，面色晄白，小便清長、下得清谷、舌質(zhì)淡苔白，脈沉遲等腎陽虛證的癥狀。老年人腎虛發(fā)生率為78.80%，其中腎陽虛證占腎虛總數(shù)的5.70%，且呈增齡性增加〔1〕。右歸丸為明代張景岳所創(chuàng)，以“陰中求陽”治法來治療腎陽虛證，在理論上與單純的溫陽治法相比更具特色及科學(xué)性。本課題組既往的研究表明〔2〕，腎陰虛證和腎陽虛證與正常對照比較外周血白細(xì)胞中存在6條共同差異表達(dá)下調(diào)的基因SYPL1、PHF14、ARHGAP18、RECQL、OSTF1和SEC23B，這些可能是腎虛證表達(dá)下調(diào)的相關(guān)基因，但其機制尚未完全闡明。本研究旨在通過RT-PCR法觀察經(jīng)右歸丸及其拆方對老年腎陽虛證患者治療前后相關(guān)基因差異表達(dá)的變化。

1對象與方法

1.1研究對象按實驗分組要求收集贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院及南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院2012年9月至2014年7月間診治病人。納入標(biāo)準(zhǔn)：采用病證結(jié)合手段，選取年齡在60歲以上，患慢性腎炎的腎陽虛證患者作為研究對象。排除標(biāo)準(zhǔn)：不符合納入標(biāo)準(zhǔn)者；處于心腦血管、腫瘤、尿毒癥等重大疾病的終末期；不愿接受研究者。

1.2腎陽虛證的辨證標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)被調(diào)查者填寫的量表內(nèi)容和現(xiàn)場調(diào)查醫(yī)師通過中醫(yī)四診掌握的資料，按《中醫(yī)診斷學(xué)》〔3〕、1986年全國虛證與老年病會議制定的《中醫(yī)虛證辨證參考標(biāo)準(zhǔn)》〔4〕，有關(guān)腎虛證的辨證標(biāo)準(zhǔn)、國家中醫(yī)藥管理局頒布《中醫(yī)病證診斷療效標(biāo)準(zhǔn)》等有關(guān)腎陽虛證的診斷標(biāo)準(zhǔn)。主癥：腰膝酸軟，性欲減退，畏寒肢冷；次癥：精神萎靡，夜尿頻多，下肢浮腫，動則氣促，發(fā)槁齒搖，舌質(zhì)淡苔白，脈沉遲，尺無力。診斷：具備以上主癥2項、次癥2項，即可確診。癥狀積分按腎陽虛證每項證候的輕、中、重程度分級量化為1分、2分、3分，癥狀總積分為主癥各項證候積分和次癥各項積分的總和。

1.3分組共納入符合條件的8例老年腎陽虛患者進(jìn)入研究，男5例，女3例，年齡(62±1.13)歲，按隨機數(shù)字法將其分為兩組，右歸丸組及溫腎陽組各4例。另將4例60歲以下健康人設(shè)為正常對照組，男2例，女2例，年齡(55±2.72)歲。按照中醫(yī)理論“陰中求陽”法，給予右歸丸及其拆方治療進(jìn)行腎陽虛證研究：右歸丸治療組，給予右歸丸(由熟地、山藥、山茱萸、枸杞、鹿角膠、菟絲子、杜仲、當(dāng)歸、肉桂、制附子組成)免煎顆粒劑，每日2次，開水沖服；溫腎陽對照組，給予右歸丸之溫腎陽中藥復(fù)方(由鹿角膠、菟絲子、杜仲、肉桂、制附子組成)免煎顆粒劑，每日2次，開水沖服。4 w為1個療程，每例患者連續(xù)用藥2個療程，分別觀察治療前及療程結(jié)束后外周血白細(xì)胞的6條基因(SYPL1、PHF14、ARHGAP18、RECQL、OSTF1和SEC23B)的差異表達(dá)，并以GAPDH作為內(nèi)參對照〔5〕。

1.4實驗試劑與儀器設(shè)備DNA抽提試劑及Trizol試劑，RNA抽提試劑，均為美國MRC公司產(chǎn)品；RNA Later 保存液，Ambion公司；實時定量PCR試劑，Takara公司；其余實驗所需常規(guī)化學(xué)試劑均來自廣州化學(xué)試劑一廠及北京博奧生物公司；實時熒光定量PCR儀ABI7500FAST，ABI公司；FeroTec Gradien PCR 基因擴增儀，北京市化學(xué)儀器廠。

1.5方法

1.5.1兩組治療前后癥狀總積分比較右歸丸組及溫腎陽組連續(xù)用藥1個療程后，觀察兩組治療前后的癥狀總積分變化。

1.5.2總RNA的提取和質(zhì)檢采集研究對象晨起空腹抗凝外周靜脈血5 ml，參照Ambion公司RiboPureTM-Blood Kit的操作步驟制備白細(xì)胞；按操作規(guī)范提取樣品總RNA后，通過核酸定量儀判斷RNA質(zhì)量，結(jié)果顯示RNA完整性較好，可以進(jìn)行下一步驟。

1.5.3熒光實時定量PCR檢測利用GenBank查詢基因的堿基序列，采用引物設(shè)計軟件Primer 3.0。實時定量PCR測定的腎陽虛證6條基因及內(nèi)參基因GAPDH引物見表1。

表1　腎陽虛證差異表達(dá)下調(diào)的6條基因及

cDNA模板制備(逆轉(zhuǎn)錄酶，RT)：在EP管中加入1 μl RNA、0.5 μl RNA酶抑制劑，0.5 μl Oligo、1 μl Rnase抑制劑，2 μl dNTPs，2 μl 5×Buffer，3 μl DEPC-H2O，將上述溶液混勻、離心，42℃水浴60 min，99℃5 min，冰上冷卻，-20℃保存，進(jìn)行實時PCR，配置相應(yīng)的RT-PCR反應(yīng)體系：2倍master mix(IQ SYBR GRN SUPERMX)10.0 μl，PCR引物各0.5 μl，cDNA 1.0 μl，無菌水 8.0 μl。

將配置完畢的PCR反應(yīng)液放置于熒光定量PCR儀上，反應(yīng)條件：變性95℃ 3 min；然后95℃ 10 s，退火55℃ 10 s；延伸72℃，30 s，共反應(yīng)39個循環(huán)。PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳后經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)拍照成像，目的基因的表達(dá)水平用其與GAPDH的相對平均灰度值表示〔6〕。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS13.0軟件，組內(nèi)比較采用配對設(shè)計資料的t檢驗，兩組間比較使用方差分析、協(xié)方差分析、單因素方差分析(One-Way ANOVA)，有統(tǒng)計學(xué)意義再行LSD法多重比較。

2結(jié)果

2.1兩組治療前后癥狀總積分比較結(jié)果治療前兩組總積分比較無顯著性差異(右歸丸組25.50±3.51，溫腎陽組24.75±3.40,F=1.149，P>0.05)；兩組總積分在治療前后均有統(tǒng)計學(xué)差異(t右歸丸=20.657，P<0.01；t溫腎陽=51.000，P<0.01)，治療后兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(右歸丸組8.50±1.29，溫腎陽組16.00±2.16,F=74.432，P<0.01)。

2.2腎陽虛證三組治療前后基因表達(dá)情況治療前后SYPL1基因，在右歸丸組和溫腎陽組的表達(dá)水平存在統(tǒng)計學(xué)差異(t左歸丸組=-35.631，t溫腎陽組=-13.000，P<0.01)，且治療后右歸丸組和溫腎陽組的表達(dá)均較治療前上升。治療后各組的SYPL1基因表達(dá)存在差異(F=487.049，P<0.01)，溫腎陽組表達(dá)上升程度不及右歸丸組。其他5種基因的表達(dá)情況與SYPL1基因狀況類似。見表2。

表2　6種基因治療前后表達(dá)

與對照組相比:1)P<0.01;與右歸丸組相比:2)P<0.01；與治療前相比：3)P<0.05

3討論

陰陽互根互用理論是陰陽學(xué)說的重要組成部分。陰陽學(xué)說的現(xiàn)代研究中最令人矚目的是美國生物學(xué)家Glodberg等〔7〕于1975年首次提出環(huán)磷酸腺苷(cAMP)與環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)的陰陽假說。隨后國際上一系列著名的科學(xué)雜志刊登應(yīng)用陰陽概念探討免疫與炎癥、氧化與抗氧化、蛋白磷酸化信號傳導(dǎo)通路、核轉(zhuǎn)錄因子抑制與激活等細(xì)胞內(nèi)的諸多事件〔8～13〕。哺乳動物的基因表達(dá)具有陰陽屬性〔14〕。李白雪〔15〕研究發(fā)現(xiàn)miRNA從本質(zhì)屬性上講，應(yīng)屬于“陰”屬性，saRNA呈現(xiàn)積極、向上、促進(jìn)等“陽”的屬性。沈自尹院士曾提出21世紀(jì)中醫(yī)藥學(xué)的主要發(fā)展趨勢將是建立中醫(yī)證的基因表達(dá)譜。分子生物學(xué)和生命的中心法則認(rèn)為基因處于最原始和最本質(zhì)的地位，主宰和制約著表型(蛋白質(zhì)→細(xì)胞→有機體)程序的發(fā)生發(fā)展〔16〕。

右歸丸見明代著名醫(yī)家張景岳的《景岳全書》，方中以大量溫陽藥為主，配有幾味滋陰藥為輔，取“陰中求陽”之義，使元陽得以歸原，故得名“右歸丸”。所謂“善補陽者，必于陰中求陽，則陽得陰助，而生化無窮”。本課題組既往研究發(fā)現(xiàn)，6條腎虛證共同差異表達(dá)下調(diào)的基因中，SYPL1(突觸泡蛋白樣1)的分子學(xué)上為轉(zhuǎn)運蛋白，在生物學(xué)過程中主要參與運輸、突觸傳遞以及傳遞神經(jīng)沖動的功能； PHF14(PHD指蛋白14)的分子功能為蛋白結(jié)合、鋅離子結(jié)合及金屬離子結(jié)合，生物學(xué)過程主要參與調(diào)控轉(zhuǎn)錄和DNA依賴； ARHGAP18(Rho GTP 激活蛋白18)的分子功能為GTP激活、酶激活劑，生物學(xué)過程參與新陳代謝、GTP結(jié)合；RECQL(RecQ蛋白樣、DNA解旋酶Q1樣)的分子功能有核苷酸結(jié)合、DNA結(jié)合、ATP依賴DNA解旋酶、蛋白結(jié)合、ATP結(jié)合、水解酶等，生物學(xué)過程主要參與了DNA的修復(fù)、蛋白質(zhì)的生物合成等； OSTF1(破骨細(xì)胞刺激因子1)分布于細(xì)胞內(nèi)，其分子功能主要為蛋白結(jié)合、骨骼發(fā)育，其生物學(xué)過程參與骨化以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等；SEC23B(Sec23同源物B)分布于細(xì)胞膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及高爾基堆疊等，其分子功能主要有蛋白結(jié)合、鋅離子結(jié)合、高爾基復(fù)合體和細(xì)胞質(zhì)囊泡等，生物學(xué)過程參與了細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的運輸、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)高爾基膜泡介導(dǎo)運輸?shù)?。這6條基因可視為腎陽虛證研究時的特征基因。

本次研究可以總結(jié)出右歸丸及溫腎陽中藥復(fù)方對老年腎陽虛患者的基因差異表達(dá)均有改善作用，右歸丸優(yōu)于單純溫腎陽復(fù)方治療效果，驗證了陰中求陽法的優(yōu)越性。老年腎陽虛患者的基因表達(dá)在短期內(nèi)不能單獨依靠藥物恢復(fù)至完全正常，需要一個長期和綜合的治療過程。

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〔2015-07-15修回〕

(編輯曲莉)