堿預(yù)處理對玉米秸稈酶解效果的影響

遲聰聰， 柳　咪， 龔亞輝， 李鴻魁， 吳養(yǎng)育

(1.陜西科技大學(xué) 輕工與能源學(xué)院 陜西省造紙技術(shù)及特種紙品開發(fā)重點實驗室， 陜西 西安　710021； 2.齊魯工業(yè)大學(xué) 制漿造紙科學(xué)與技術(shù)教育部重點實驗室， 山東 濟南　250353； 3.中興通訊股份有限公司， 陜西 西安　710065)

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堿預(yù)處理對玉米秸稈酶解效果的影響

遲聰聰1,2， 柳咪1， 龔亞輝3， 李鴻魁1， 吳養(yǎng)育1

(1.陜西科技大學(xué) 輕工與能源學(xué)院 陜西省造紙技術(shù)及特種紙品開發(fā)重點實驗室， 陜西 西安710021； 2.齊魯工業(yè)大學(xué) 制漿造紙科學(xué)與技術(shù)教育部重點實驗室， 山東 濟南250353； 3.中興通訊股份有限公司， 陜西 西安710065)

摘要：在不同條件下對玉米秸稈進行堿預(yù)處理，研究了其對整個轉(zhuǎn)化過程糖得率的影響，從而為木質(zhì)纖維素預(yù)處理及酶水解的分形研究奠定了基礎(chǔ).研究結(jié)果表明，堿預(yù)處理提取液的固含量隨堿濃的增大而上升，這可能是堿降解木質(zhì)素所致，木糖得率整體呈上升趨勢，不同條件預(yù)處理后底物的酶水解糖得率存在明顯差異.以預(yù)處理提取液與酶水解液中總糖得率之和作為評價指標(biāo)，通過正交試驗設(shè)計,獲得了本研究預(yù)處理條件范圍內(nèi)的優(yōu)化結(jié)果為：溫度70 ℃、堿濃15%、時間6 h.極差分析三因素對預(yù)處理提取液及酶水解液中總糖得率影響的主次順序為：堿濃>溫度>時間.方差分析結(jié)果表明，堿濃對整個轉(zhuǎn)化過程總糖得率具有顯著影響，而溫度和時間的影響則不顯著.

關(guān)鍵詞：玉米秸稈； 堿預(yù)處理； 酶水解

0引言

近年來，隨著經(jīng)濟全球化發(fā)展、科技進步以及人們生活水平的提高，資源短缺與能源危機日益加劇，因此人們越來越關(guān)注于尋找一種可持續(xù)利用的生物質(zhì)能源，以減少人類對傳統(tǒng)石化資源的依賴[1,2].其中，生物質(zhì)轉(zhuǎn)化燃料乙醇，因其可再生及少污染等特性而成為最具應(yīng)用前景的可再生能源之一，已經(jīng)引起了人們的廣泛關(guān)注[3].

木質(zhì)纖維原料轉(zhuǎn)化為燃料乙醇，主要包括原料預(yù)處理、酶水解和戊糖己糖發(fā)酵等工藝[4].由于木質(zhì)纖維原料結(jié)構(gòu)致密復(fù)雜，纖維素結(jié)晶度高，不利于酶水解，因此酶解前必須經(jīng)過預(yù)處理，以提高酶對纖維素的可及度，從而提高酶解效率[5,6].最理想的結(jié)果是預(yù)處理既可有效提高酶解效率，又能降低總轉(zhuǎn)化成本.

目前，常見的預(yù)處理方法主要有物理法、化學(xué)法和生物法[7].其中，物理法預(yù)處理雖然能對生物質(zhì)內(nèi)部結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定的破壞作用，但破壞程度較低，且需較高能耗；化學(xué)預(yù)處理技術(shù)則要求反應(yīng)設(shè)備耐酸堿腐蝕，因為稀酸和稀堿在一定條件下處理生物質(zhì)原料時具有處理效率高、耗時短、能耗低、能連續(xù)操作等優(yōu)點；生物法利用特定的微生物對纖維素、木質(zhì)素進行降解，反應(yīng)條件溫和，但該過程反應(yīng)時間長，并且對反應(yīng)環(huán)境要求嚴(yán)格，降解效率亦較低[8,9].

劉偉等[10]采用稀硫酸、氫氧化鈉、氨水及氫氧化鈣分別對玉米秸稈進行預(yù)處理，發(fā)現(xiàn)氫氧化鈉預(yù)處理效果更佳，總還原糖得率與未預(yù)處理相比時提高了10.7倍;Jeya等[11]采用正交設(shè)計研究發(fā)現(xiàn)堿預(yù)處理對纖維素酶水解具有一定的促進作用;Ibrahim等[12]采用氫氧化鈉預(yù)處理稻草秸稈，發(fā)現(xiàn)預(yù)處理后稻草秸稈的綜纖維素含量增加，而木素含量降低，有利于后續(xù)酶水解.

本研究以玉米秸稈為原料，磨粉后進行氫氧化鈉預(yù)處理，酶解糖化后以預(yù)處理提取液與酶解液中的總還原糖得率之和作為評價指標(biāo)，獲得了較好的預(yù)處理工藝條件.該研究結(jié)果對木質(zhì)纖維素預(yù)處理及酶水解過程的分形研究具有指導(dǎo)意義.

1實驗部分

1.1實驗原料

玉米秸稈取自西安市馬王鎮(zhèn)，風(fēng)干、去除外層葉片、切段、磨粉、篩選，取未通過40目篩的粉末作為研究對象.

1.2主要儀器及試劑

(1)主要儀器：THZ-82型數(shù)顯水浴恒溫振蕩器，常州博遠實驗分析儀器廠；飛鴿牌系列KA-1000型離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠；UV752型紫外可見分光光度計，上海佑科儀器儀表有限公司；PHS-3C型PH計，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司.

(2)主要試劑：氫氧化鈉，分析純，天津市進豐化工有限公司；間苯三酚，分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；木糖，生化試劑，上海伯奧生物科技有限公司；葡萄糖，分析純，天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司；纖維素酶，生化試劑，國藥集團化學(xué)試劑有限公司，采用3，5-二硝基水楊酸(DNS)法[13]測定其酶活為0.031 FPU/g.

1.3實驗方法

1.3.1堿預(yù)處理

堿預(yù)處理在恒溫振蕩水浴鍋中進行.反應(yīng)條件為：絕干玉米秸稈粉5 g，振蕩轉(zhuǎn)速140 rpm，固液比1∶10(g∶mL)，氫氧化鈉溶液濃度1%、5%、10%、15%等，溫度60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃等，預(yù)處理反應(yīng)時間3 h、6 h、9 h、12 h等.

反應(yīng)結(jié)束后，固液分離，玉米秸稈粉用去離子水充分洗滌至中性，風(fēng)干備酶水解用，預(yù)處理提取液用于分析單糖濃度及固形物含量.其預(yù)處理條件及對應(yīng)試樣編號如表1所示.

表1　預(yù)處理條件

續(xù)表1

試樣編號溫度/℃堿濃/%時間/h5678701510156312991011128015101591236131415169015101512963171819202180101112131466666

注：反應(yīng)時間均為保溫時間

1.3.2酶解糖化

將章節(jié)1.3.1所得底物在恒溫振蕩水浴鍋中進行酶水解.酶解條件為：溫度50 ℃，轉(zhuǎn)速180 rpm，反應(yīng)時間48 h，底物濃度5%，酶用量1 g/kg底物，乙酸/乙酸鈉緩沖溶液pH=4.8.酶解完成后,進行固液分離，酶解液離心后取上清液，待還原糖分析用.

1.3.3還原糖分析

參考文獻酶解液及堿預(yù)處理提取液中的五碳糖及六碳糖分析，采用紫外-可見分光光度計，其具體方法可[14].酶解還原糖產(chǎn)率y1及預(yù)處理提取液中還原糖得率y2的計算公式如下：

(1)

(2)

1.3.4原料中總糖分析

將經(jīng)過苯醇抽提過后的玉米秸稈粉試樣進行兩步酸水解[15].第一步先用72% H2SO4處理，常溫下保溫2.5 h；第二步用3%H2SO4水解并煮沸反應(yīng)4 h.反應(yīng)結(jié)束后進行固液分離，按照章節(jié)1.3.3所述分析濾液中五碳糖與六碳糖的含量，兩者之和即為原料中總糖.

2結(jié)果與討論

2.1預(yù)處理對提取液的影響

玉米秸稈粉在不同條件下進行堿預(yù)處理，其提取液的固形物及木糖得率結(jié)果如表2所示.由表2可知，在一定范圍內(nèi)，當(dāng)溫度及反應(yīng)時間一定時，預(yù)處理提取液的固含量(不包含堿)隨堿濃的增大而升高，這可能是由于在堿的作用下，木質(zhì)素與碳水化合物間的連接鍵斷裂，破壞了木質(zhì)素結(jié)構(gòu)進而達到去除木質(zhì)素的目的[16]；此外，半纖維素也會發(fā)生一定程度的水解而溶出小分子碎片.

NaOH亦會使纖維素產(chǎn)生明顯的潤脹作用，增加內(nèi)表面積及降低纖維素結(jié)晶度[17].提取液的糖類分析結(jié)果表明，其主要組分為木糖，幾乎不含葡萄糖，這是因為NaOH可以有效去除玉米秸稈結(jié)構(gòu)中的乙酰基，有利于半纖維素降解；另一方面，由于研究所用測糖方法主要用于分析五碳糖，再加上提取液中葡萄糖量相對較少，因而結(jié)果顯示葡萄糖含量接近零.

結(jié)合表2中木糖得率隨堿濃的變化趨勢，雖然兩者之間無明顯線性關(guān)系，但當(dāng)堿濃最高為15%時，木糖得率最高為30.15%.這可能是因為堿濃越高，去除木質(zhì)素越多，因而增加了堿與半纖維素的接觸面積而使得最大程度地向木糖轉(zhuǎn)化.

表2　玉米秸稈堿提取液分析結(jié)果

注：木糖得率=預(yù)處理液中木糖/原料中總糖，下同.

2.2堿濃對提取液及酶解液中總糖得率的影響

預(yù)處理條件對提取液及酶解液中總還原糖得率的影響如圖1所示.圖1(b)顯示，堿濃越高，則預(yù)處理提取液中總糖得率亦越高.

由圖1(a)可知，酶解液中主要成分為葡萄糖且得率較低，木糖含量則較少且保持穩(wěn)定狀態(tài).這是由于纖維素酶主要降解纖維素為葡萄糖，而對半纖維素幾乎不起作用，并且其酶活及酶解效率較低.因此，圖1(a)中所示總糖與葡萄糖的變化趨勢相一致，但與木糖的變化趨勢則大不相同.

由圖1(a)還可發(fā)現(xiàn)，隨著堿濃升高，酶解液中葡萄糖得率并非線性遞增，而是呈現(xiàn)先增加后減少最后又增加的趨勢，這可能是因為在預(yù)處理階段，由于堿濃較高，預(yù)處理提取液中降解溶出的還原糖量較大(符合圖1(b)中預(yù)處理還原糖的變化趨勢)，導(dǎo)致酶水解底物中的總糖含量較低，因而酶解糖得率亦較低，但也有可能是因為測量誤差所致.

(a)酶解總糖

(b)預(yù)處理提取液及酶解液總糖圖1　堿濃對轉(zhuǎn)化過程糖得率的影響(預(yù)處理條件為：溫度70 ℃、時間6 h、轉(zhuǎn)速140 rpm)

圖1(b)還表明,預(yù)處理及酶水解過程所得總糖得率之和隨著堿濃的升高而基本呈上升趨勢.當(dāng)堿濃為13%及14%時，糖得率雖有小幅下降，但波動不大，這可能是由于測量誤差所致.

2.3預(yù)處理工藝優(yōu)化

影響木質(zhì)纖維素堿預(yù)處理效果的因素主要有時間、溫度、堿濃等.本試驗以此3個因素為研究對象，設(shè)計了L16(45)正交試驗,并以預(yù)處理提取液與酶解液中總還原糖得率之和作為主要評價指標(biāo)進行了分析比較.

2.3.1正交試驗極差分析

為進一步明確各因素對總還原糖得率的響應(yīng)關(guān)系，對正交試驗進行極差分析,如表3所示，并作因素與水平效應(yīng)曲線，如圖2所示.

從極差分析結(jié)果可以看出,三因素對總還原糖得率影響的主次順序為：堿濃>溫度>時間；三因素的最優(yōu)水平為：溫度70 ℃、堿濃10%、時間6 h.堿濃是影響總還原糖得率的最主要因素，而在設(shè)計正交試驗過程中堿濃的四水平間隔較大，因而在溫度70 ℃、時間6 h的條件下進一步細化堿濃(10%、11%、12%、13%、14%、15%等)對總還原糖得率的影響，由圖1(b)可知，當(dāng)堿濃為15%時，其預(yù)處理提取液及酶解液中總還原糖得率之和最高，達31.14%，由此可知其最佳預(yù)處理條件為:溫度70℃、堿濃15%、時間6 h.

表3　正交試驗極差分析結(jié)果

從正交試驗因素與水平效應(yīng)曲線可以進一步看出各因素對響應(yīng)值的影響，圖(2)中各點代表各因素不同水平下的值.由圖2(a)可以看出，溫度60 ℃和70 ℃時的總還原糖得率差別不大，且溫度的影響效果不顯著，故從經(jīng)濟效益角度考慮，預(yù)處理溫度可以選擇60 ℃；圖2(b)顯示出堿濃對還原糖得率的影響較大，在不同堿濃下的總糖得率差異較大；圖2(c)表明預(yù)處理時間對總糖得率的影響亦較大，但相比堿濃稍弱，這與正交試驗的極差分析結(jié)果相一致.

(a)溫度對總糖得率的影響

(b)堿濃對總糖得率的影響

(c)時間對總糖得率的影響圖2　正交試驗因素與指標(biāo)效應(yīng)曲線(縱坐標(biāo)為預(yù)處理提取液與酶解液中總還原糖得率之和)

2.3.2正交試驗方差分析

對上述正交試驗進行方差分析，其結(jié)果見表4所示.

表4　正交試驗的方差分析結(jié)果

從表4可以看出：總還原糖得率影響因素的主次順序為B>A>C，即堿濃>溫度>時間，得到的最優(yōu)組合為A2B3C2，即溫度70 ℃、堿濃10%、時間6 h.同時，對各因素影響顯著性水平進行F檢驗，其結(jié)果顯示，因素A和C對響應(yīng)值的影響均不顯著，因素B對響應(yīng)值具有顯著影響.

通過正交試驗方差分析結(jié)果可以進一步看出，堿濃是影響堿預(yù)處理的主要因素，其對木質(zhì)素的去除具有顯著影響，從而影響了總糖得率.

3結(jié)論

(1)NaOH預(yù)處理可降解部分半纖維素及木質(zhì)素.在一定范圍內(nèi)，當(dāng)溫度及反應(yīng)時間一定時，隨著堿濃增大，其固含量升高，木糖得率整體呈上升趨勢.

(2)在不同堿濃、時間及溫度的預(yù)處理條件下，預(yù)處理提取液與酶解液中總還原糖得率有明顯差異.本試驗條件范圍內(nèi)的優(yōu)化結(jié)果為：堿濃15%、時間6 h、溫度70 ℃.

(3)影響NaOH預(yù)處理效果的三因素對整個轉(zhuǎn)化過程還原糖得率影響的主次順序為:堿濃>溫度>時間；其方差分析結(jié)果顯示，堿濃對轉(zhuǎn)化過程總糖得率具有顯著影響，而溫度和時間的影響則不顯著.

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Effects of alkaline pretreatment on the enzymatic

hydrolysis efficiency of corn straw

CHI Cong-cong1,2， LIU Mi1， GONG Ya-hui3， LI Hong-kui1， WU Yang-yu1

(1.College of Light Industry and Energy, Shaanxi Province Key Laboratiory of Papermaking Technology and Specialty Paper, Shaanxi University of Science & Technology, Xi′an 710021, China; 2.Key Laboratory of Pulp and Paper Science & Technology of Ministry of Education, Qilu University of Technology, Jinan 250353， China; 3.Zhongxing Telecommunication Equipment Corporation, Xi′an 710065, China)

Abstract:Alkaline pretreatment was done on corn straw powder under different conditions.The impact on the total yield of reducing sugar is investigated,which will lay foundation for the fractal characterization of lignocellulose pretreatment and enzymatic hydrolysis.Results show that the solid content in the filtrate is higher for higher alkaline concentration,which maybe the cause of lignin degradation,while the variation trend of xylose yield is increased.There is remarkable difference of sugars yield throughout the total process among different pretreatment conditions.Based on the orthogonal experimental design,the optimum condition within the range of our experiments is alkali dosage 15% at 70 ℃ for 6 hours,which is evaluated by the total reducing sugar yield.Range analysis results show that the order in effects of total sugars yield is:alkali concentration>temperature>reaction time.The variance analysis indicates that alkali concentration has significant impact on the total sugars yield,while temperature and time are insignificant.

Key words:corn straw; alkaline pretreatment; enzymatic hydrolysis

中圖分類號：TQ353

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1000-5811(2015)05-0013-06

作者簡介:遲聰聰(1981-)，女，山東青島人，講師，博士，研究方向：木質(zhì)纖維資源高效轉(zhuǎn)化及應(yīng)用

基金項目：教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點專項科研基金項目(20126125120002); 陜西省科技廳自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計劃青年人才項目(2015JQ3077)； 齊魯工業(yè)大學(xué)制漿造紙科學(xué)與技術(shù)教育部重點實驗室開放基金項目(KF201401)； 陜西科技大學(xué)博士科研啟動基金項目(BJ11-18)；

收稿日期:*2015-07-11