食管鱗狀細(xì)胞癌組織中轉(zhuǎn)移抑制基因、基質(zhì)金屬蛋白酶-2的表達(dá)及臨床意義

食管鱗狀細(xì)胞癌組織中轉(zhuǎn)移抑制基因、基質(zhì)金屬蛋白酶-2的表達(dá)及臨床意義

黃志軍林建清陳志耀楊寧

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，福建泉州362000)

摘要〔〕目的探討食管鱗狀細(xì)胞癌組織中轉(zhuǎn)移抑制基因(nm23-H1)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)蛋白的表達(dá)及其臨床意義。方法選取手術(shù)切除并經(jīng)病理學(xué)證實的食管鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)本30例及正常食管黏膜標(biāo)本30例，采用免疫組化S-P法檢測nm23-H1、MMP-2蛋白在食管鱗狀細(xì)胞癌組織和正常食管黏膜中的表達(dá)。結(jié)果nm23-H1蛋白在食管鱗狀細(xì)胞癌中的陽性率為43.3%(13/30)，在正常食管黏膜組織中的陽性率為100%(30/30)，兩者間差異顯著(χ2=22.083，P<0.05)。MMP-2蛋白在食管鱗狀細(xì)胞癌中的陽性率為90.0%(27/30)，在正常食管黏膜組織中的陽性率為33.3%(10/30)，兩者間差異顯著(χ2=28.370，P<0.05)；nm23-H1、MMP-2在食管鱗癌中的表達(dá)與患者性別、年齡及腫瘤大小無關(guān)(P>0.05)，與腫瘤的分化程度、浸潤深度及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0．05)；nm23-H1的表達(dá)與切端癌殘留有關(guān)(P<0.05)，MMP-2的表達(dá)與切端癌殘留無關(guān)(P>0.05)；食管鱗狀細(xì)胞癌中nm23-H1與MMP-2的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性。結(jié)論nm23-H1、MMP-2均在食管癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮作用，均可促進(jìn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的發(fā)生；nm23-H1的表達(dá)缺失可能與切端癌殘留有關(guān)；nm23-H1、MMP-2可作為判斷食管癌轉(zhuǎn)移及預(yù)后的指標(biāo)。

關(guān)鍵詞〔〕食管鱗狀細(xì)胞癌；轉(zhuǎn)移抑制基因；基質(zhì)金屬蛋白酶-2；免疫組化

中圖分類號〔〕R73〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A〔

第一作者：黃志軍(1973-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事食管癌、結(jié)直腸癌、胃癌研究。

食管癌是一種常見的惡性腫瘤，具有較高的侵襲力，發(fā)現(xiàn)時多處于中晚期，發(fā)展迅速且生存率較低，已引起人們的廣泛關(guān)注。nm23基因是近年發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)移抑制基因，在人類基因組中有nm23-H1和nm23-H2，前者與癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的關(guān)系更為密切?；|(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)，是MMP家族中的重要成員之一，可以降解基膜中的膠原和細(xì)胞間基質(zhì)，促進(jìn)腫瘤的擴散轉(zhuǎn)移〔1〕。本研究通過免疫組化方法檢測nm23-H1、MMP-2在食管鱗狀細(xì)胞癌及正常食管黏膜中的表達(dá)，并探討其臨床意義。

1資料與方法

1.1一般資料收集2010年1月至2012年1月期間我院手術(shù)切除并經(jīng)病理學(xué)證實的食管鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)本30例。所有病例資料完整，取材前均未經(jīng)化療或放療。所有標(biāo)本均經(jīng)病理專家診斷認(rèn)定。其中，男21例，女9例；年齡50～66歲，平均(86±6)歲。手術(shù)切除組織均經(jīng)10%福爾馬林液固定，石蠟包埋切片。伴有區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移13例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移17例。依據(jù)TNM分期標(biāo)準(zhǔn)將所有患者分為Ⅰ～Ⅳ期。本研究中Ⅰ+Ⅱ期6例，Ⅲ+Ⅳ期24例。同時選取正常食管黏膜標(biāo)本30例，男18例，女12例；年齡50～70歲，平均(55±5)歲。并去其血清標(biāo)本。兩組患者年齡、性別比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

1.2主要儀器及試劑MMP-2 ELISA試劑盒(美國R&D公司)；nm23-H，單克隆抗體(鼠抗人，Cruz公司)。美國Bio-rad 505酶標(biāo)儀；微量移液器(美國Eppendorf公司)；小型高速低溫離心機(Sigma，德國)；微量振蕩器(江蘇省金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠)。

1.3MMP-2檢測①取出凍存標(biāo)本，在室溫下融化，并設(shè)標(biāo)準(zhǔn)曲線的抗體標(biāo)準(zhǔn)濃度。②加入已按要求倍數(shù)稀釋的抗體標(biāo)準(zhǔn)液和標(biāo)本至相應(yīng)孔內(nèi)，用封板膠紙封住反應(yīng)孔，室溫孵育120 min。③按洗滌方法洗板。除空白孔外，每孔加按說明書要求稀釋的生物素標(biāo)注的二抗100 μl，封住板孔，室溫孵育90 min。⑤按洗滌方法洗板。⑥除空白孔外，每孔加已按要求稀釋的酶聯(lián)物100 μl，封住板孔，室溫30 min。⑦按洗滌方法洗板。⑧每孔加底物A、B各50 μl，避光20 min。⑨每孔加終止液50 μl，即刻在450 nm酶標(biāo)儀測定標(biāo)本的吸光度，畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出樣本的MMP-2的水平。檢測由同一檢驗師操作，步驟嚴(yán)格按照操作說明進(jìn)行，嚴(yán)格質(zhì)控。使用前將所有試劑帶到室溫條件下。所有的待測樣本、標(biāo)準(zhǔn)品以及控制對照均需雙份測定。

1.4nm23-H1檢測載玻片經(jīng)常規(guī)處理后，涂防脫片膠APES(50 ml丙酮中加入APES 1 ml)，烤箱烘干后備用，標(biāo)本經(jīng)常規(guī)石蠟包埋，然后切片后備用。免疫組化：切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度酒精至水后，實驗組加nm23-H1，I抗(稀釋倍數(shù)1∶50)置濕盒4℃冰箱過夜，之后加Ⅱ抗(羊抗鼠LgG)室溫下反應(yīng)40 min，再加Ⅲ抗。室溫下反應(yīng)40 min。最后DAB顯色2～8 min，在顯微鏡下觀察顯色情況。實驗對照：在反應(yīng)中省略第一抗體作為陰性對照。免疫組織化學(xué)染色嚴(yán)格按照SP試劑盒說明書進(jìn)行。蛋白表達(dá)情況據(jù)Shiozaki等〔2〕介紹的方法進(jìn)行定性及半定量分類。

1.5結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)nm23-H1、MMP-2陽性表達(dá)均位于細(xì)胞質(zhì)中，顯示黃棕色顆?；驁F(tuán)塊。鏡下選擇有代表性的5個視野(400倍)，總計數(shù)>1 000個細(xì)胞。按陽性細(xì)胞所占百分?jǐn)?shù)分為：陽性細(xì)胞率<25%為陰性(-)；>125%為陽性(+)。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS13.0軟件包進(jìn)行χ2檢驗、Fisher確切概率法分析，相關(guān)性采用列聯(lián)資料χ2檢驗分析。

2結(jié)果

2.1nm23-H1、MMP-2表達(dá)情況nm23-H1蛋白在食管鱗狀細(xì)胞癌中的陽性率為43.3%(13/30)，在正常食管黏膜組織中的陽性率為100%(30/30)，兩者間差異顯著(χ2=22.083，P<0.05)。MMP-2蛋白在食管鱗狀細(xì)胞癌中的陽性率為90.0%(27/30)，在正常食管黏膜組織中的陽性率為33.3%(10/30)，兩者間差異顯著(χ2=28.370，P<0.05)。

2.2nm23-H1、MMP-2表達(dá)與食管鱗癌臨床病理資料的關(guān)系見表1。nm23-H1、MMP-2在食管鱗癌中的表達(dá)與患者性別、年齡及腫瘤大小無關(guān)(P>0.05)，與腫瘤的分化程度、浸潤深度及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)；nm23-H1的表達(dá)與切端癌殘留有關(guān)(P<0.05)，MMP-2的表達(dá)與切端癌殘留無關(guān)(P>0.05)。

表1　nm23-H1、MMP-2表達(dá)與食管鱗癌臨床病理

2.3nm23-H1與MMP-2在食管鱗癌中表達(dá)的相關(guān)性食管鱗狀細(xì)胞癌中nm23-H1與MMP-2的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性(列聯(lián)系數(shù)=-0.353，P=0.007)。

3討論

nm23是美國國立癌癥研究所于1988年分離并證實與腫瘤轉(zhuǎn)移抑制有關(guān)的基因，nm23-H1基因是該基因家族中六個成員之一，與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系最密切，引起人們的廣泛關(guān)注〔3，4〕。其在不同腫瘤中的作用機制不同且比較復(fù)雜，目前認(rèn)為nm23-H1基因編碼產(chǎn)物二磷酸核苷激酶(NDPK)參與微管的集合和分解，改變細(xì)胞骨架形態(tài)，影響細(xì)胞的活動和細(xì)胞間的黏附，起到抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用〔5，6〕。nm23-H1基因突變或缺失，造成對細(xì)胞減數(shù)分裂障礙和移動的抑制作用喪失，影響細(xì)胞的分化及發(fā)育并促進(jìn)腫瘤發(fā)展〔7～9〕。nm23-H1蛋白在食管鱗狀細(xì)胞癌中異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移的關(guān)系，各家的報道稍有差異。有研究認(rèn)為nm23在分化低的食管癌中表達(dá)明顯低于中高分化癌，且在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組表達(dá)顯著低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移〔10〕。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)〔11〕，nm23-H1蛋白在高分化食管癌中表達(dá)高于中低分化癌，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，認(rèn)為nm23-H1與食管癌的分化程度無關(guān)。近年又有研究發(fā)現(xiàn)〔12〕，nm23-HI蛋白的表達(dá)與食管癌的浸潤深度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等相關(guān)。本實驗顯示nm23-H1基因表達(dá)缺失與食管鱗癌的發(fā)生密切相關(guān)，可能在食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用，其表達(dá)減少或不表達(dá)可以促進(jìn)腫瘤的發(fā)生及浸潤轉(zhuǎn)移，還可能導(dǎo)致手術(shù)切端癌殘留，可作為臨床上判斷食管鱗癌轉(zhuǎn)移及預(yù)后的指標(biāo)之一〔13～15〕。MMP-2是MMPs家族中的重要成員之一，具有降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的功能，過高表達(dá)可能在腫瘤細(xì)胞的浸潤、轉(zhuǎn)移中起到重要作用〔16〕。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)MMP-2的表達(dá)與性別、年齡、切端癌殘留及腫瘤大小無關(guān)，而與腫瘤的分化程度、浸潤深度及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，與相關(guān)文獻(xiàn)報道基本一致〔17〕，表明MMP-2與食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，過高表達(dá)可促進(jìn)腫瘤的局部浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，也可作為判斷食管鱗癌預(yù)后的分子標(biāo)志。nm23-H1與MMP-2在食管癌中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，兩者分別作為腫瘤擴散的抑制因素和促進(jìn)因素，在食管癌發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮作用。nm23-H1的表達(dá)缺失和MMP-2的過高表達(dá)均可造成食管癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移，兩者的異常表達(dá)可能有協(xié)同作用〔18〕。因此，同時檢測兩個指標(biāo)在食管鱗癌組織中的表達(dá)，能更準(zhǔn)確的預(yù)示腫瘤的轉(zhuǎn)移及預(yù)后情況，兩者間的相互作用機制還有待進(jìn)一步研究。

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〔2013-09-18修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)