正交設(shè)計優(yōu)化光敏劑二氫卟吩e6-C15單甲酯的合成工藝

·論著·

正交設(shè)計優(yōu)化光敏劑二氫卟吩e6-C15單甲酯的合成工藝

單彬1，孫渺2，孟志2，韓貴焱2，錢其涵2，劉明輝1，姚建忠1,2(1. 福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350108; 2. 第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，上海 200433)

[摘要]目的優(yōu)化光敏劑二氫卟吩e6-C15單甲酯 (1)的合成工藝。方法采用“一鍋法”，以脫鎂葉綠酸a(3)為原料，通N2條件下經(jīng)堿甲醇液作用下E環(huán)開裂后直接添加1/20體積量的水，回流水解制得化合物1。選擇影響其合成產(chǎn)率的開環(huán)反應(yīng)時間(A)、回流水解反應(yīng)時間(B)、氫氧化鉀甲醇液濃度(C)、3與氫氧化鉀的質(zhì)量投料比(D)為主要考察因素，每個因素各取3個水平，采用L9(34)正交試驗法優(yōu)化目標物1的最佳合成工藝。結(jié)果合成化合物1的最優(yōu)反應(yīng)條件為B1C2A2D1，工藝收率從43.0%提高到56.5%。結(jié)論該工藝具有操作簡便、安全、收率高等優(yōu)點，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

[關(guān)鍵詞]工藝改進；二氫卟吩e6-C15單甲酯；正交設(shè)計；光敏劑

[基金項目]國家自然科學(xué)基金(81172950)；上海市科委重點科技攻關(guān)項目(11431920401)

[作者簡介]單彬, 碩士研究生. E-mail: shanbin19890518@163.com

[通訊作者]姚建忠. 研究方向：抗腫瘤和抗真菌藥物研究. Tel: (021)81871235；E-mail：yaojz@sh163.net

[中圖分類號]R916.42[文獻標志碼]A

DOI[]10.3969/j.issn.1006-0111.2015.02.007

[收稿日期]2014-08-26[修回日期]2014-11-17

Optimization of synthesis of photosensitizer chlorin e6-C15monomethyl ester by the orthogonal design

SHAN Bin1, SUN Miao2,MENG Zhi2, HAN Guiyan2, QIAN Qihan2, LIU Minghui1, YAO Jianzhong1,2(1. Department of Pharmacy, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350108, China; 2. School of Pharmacy, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)

Abstract[]ObjectiveTo optimize the synthesis of photosensitizer chlorine e6-C15 monomethyl ester (1).MethodsTarget compound 1 was synthesized through E ring cracking of pheophorbide a (3) in methanol solution of potassium hydroxide followed by adding H2O for ester hydrolysis with “one-pot” process. Four main factors that influencing the synthetic yield of target compound 1 are ring cleavage reaction time (A), reflux hydrolysis reaction time (B), alkali concentration (C) and weight ratio of material 3 to alkali (D). Each of the four factors was chosen at three levels and evaluated by the orthogonal experimental design of L9 (34). ResultsThe optimization terms of the synthesis of target compound 1 were B1C2A2D1. The yield of compound 1 was raised from 43.0% to 56.5%. ConclusionThe developed process has the advantages of simple operation, good safety and high reaction yield, and is suitable for industrial production.

[Key words]process improvement; chlorine e6-C15monomethyl ester; orthogonal design; photosensitizer

光動力療法(photodynamic therapy，PDT)是20世紀80年代初發(fā)展起來的一種腫瘤治療新技術(shù)，即用特定波長的光輻照攝入光敏劑的病灶組織，由光敏劑誘發(fā)產(chǎn)生單線態(tài)氧等細胞毒活性氧物質(zhì)而導(dǎo)致靶組織細胞壞死或凋亡[1]。與第一代臨床卟啉類光敏劑如血卟啉衍生物(hematoporphyrin derivative，HpD)相比，二氫卟吩類光敏劑如葉綠素降解產(chǎn)物及其衍生物等具有結(jié)構(gòu)明確、紅光治療區(qū)(λ>600 nm)最大吸收波長紅移至670～700 nm且吸收系數(shù)高一個數(shù)量級、光敏作用強、體內(nèi)清除速度快、光毒性小等優(yōu)點，已成為新一代PDT光敏新藥研究的熱點之一[2-4]。其中，維替泊芬(verteporfin)和他拉泊芬(talaporfin)于2001年和2004年先后在美國及日本獲準上市[5]。

二氫卟吩e6-C15單甲酯(1)為葉綠素a降解產(chǎn)物，研究表明[6]，其光敏化力及對小鼠肉瘤-180移植瘤的PDT療效顯著高于HpD，腫瘤/正常皮膚分布比達2～10，48 h體內(nèi)基本清除完畢，皮膚光毒性小，且理化性質(zhì)穩(wěn)定，是新一代有希望的光動力治癌候選藥物。文獻[7]報道，以蠶沙葉綠素a粗提物(糊狀葉綠素)經(jīng)酸降解制得的脫鎂葉綠酸a(3)粗品為原料，其乙醚液在0.5%(W/V)氫氧化鉀甲醇溶液中于通氮氣條件下，開環(huán)反應(yīng)得到二氫卟吩e6二甲酯(2)，2再經(jīng)約1%(W/V)氫氧化鉀的甲醇-水(V/V, 20∶1)回流水解合成得目標產(chǎn)物1(圖1)，但其反應(yīng)收率偏低(43.0%)。本實驗旨在采用“一鍋法”簡化合成操作，并利用正交試驗設(shè)計優(yōu)化其合成反應(yīng)工藝，提高其合成收率。

圖1　二氫卟吩e 6-C 15單甲酯(1)的合成

1材料與儀器

用HPLC法測定：Water-600型高效液相儀(美國)，分離柱：ZORBAX ODS柱(0.46 cm×25 cm)，流動相：60%THF水溶液+10% 0.2 mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液，流速：1 ml/min，檢測波長：401 nm，靈敏度：0.1 AUFS。柱層析硅膠H(60型)由青島海洋化工集團公司出品。糊狀葉綠素由浙江省海寧市天然色素廠生產(chǎn)。脫鎂葉綠酸a(2)粗品按文獻[8]方法制備，其余所用化學(xué)試劑均為市售分析純。

2方法

2.1正交試驗設(shè)計為了優(yōu)化合成目標化合物1的最佳合成工藝，采用L9(34)正交設(shè)計[9]對反應(yīng)條件進行優(yōu)選。根據(jù)反應(yīng)的性質(zhì)并參照文獻方法，我們嘗試用“一鍋法”，即原料3經(jīng)氫氧化鉀甲醇液作用下E環(huán)室溫開裂生成2后，直接添加1/20體積量的水回流水解合成制得目標產(chǎn)物1。重點考察了影響其合成收率的開環(huán)反應(yīng)時間(A)、回流水解反應(yīng)時間(B)、氫氧化鉀甲醇液濃度(W/V，C)、3與氫氧化鉀的質(zhì)量投料比(X∶Y，D)4個主要因素，每個因素各取3個水平(表1)。

表1　正交試驗設(shè)計因素水平表

2.2二氫卟吩e6-C15單甲酯(1)的合成稱取Xg同一批號脫鎂葉綠酸a(3)粗品(HPLC法檢測純度為55%)，加入Yg氫氧化鉀溶于甲醇而成的某濃度(W/V，C)的醇堿溶液，室溫通氮氣攪拌反應(yīng)一定時間(A)，然后加入1/20體積量的水，迅速回流反應(yīng)一定時間(B)，停止反應(yīng)，加2倍體積量水稀釋，用10%硫酸調(diào)節(jié)pH值至5～6，過濾，五氧化二磷(P2O5)真空干燥，得黑色粉末1粗品。

3結(jié)果

3.1二氫卟吩e6-C15單甲酯(1)合成反應(yīng)條件的優(yōu)化將表1按L9(34)正交表的試驗序號順序，依次采用相應(yīng)條件重復(fù)進行3次平行試驗。根據(jù)上述合成方法，每次試驗均取同一批號2粗品5.0 g(HPLC法檢測相對含量為55%，理論上含3純品2.75 g)，所得1粗品均為4.5 g，非常穩(wěn)定。用HPLC法測定1粗品的相對百分含量即純度來衡量其產(chǎn)率的高低。

極差分析數(shù)據(jù)和計算結(jié)果見表2。正交分析所用正交表各列除因子列外，無空白列作對照，故采用重復(fù)試驗方差分析的方法[10]，計算各因子列的F比值，方差分析結(jié)果見表3。

表3方差分析表明，因素B、C、A對結(jié)果的影響均非常顯著。表2極差(R)分析結(jié)果進一步顯示，各因素對產(chǎn)物1粗品純度的影響按B>C>A>D順序遞減。因此，制備目標產(chǎn)物1的最優(yōu)反應(yīng)條件應(yīng)為B1C2A2D1。

3.2二氫卟吩e6-C15單甲酯(1)最優(yōu)合成反應(yīng)條件的驗證以3粗品15.0 g(HPLC法檢測純度為55%，理論上內(nèi)含純品8.25 g，13.94 mmol)按上述最優(yōu)反應(yīng)條件，即加入1.0%(W/V)的氫氧化鉀甲醇溶液500 ml，室溫通氮氣攪拌反應(yīng)4 h后，再加水25 ml，迅速回流反應(yīng)0.5 h，停止反應(yīng)，加2倍體積量水稀釋， 用10%硫酸調(diào)節(jié) pH 值至5～6， 過濾，P2O5真空干燥，重復(fù)實驗3批，平均每批得黑色粉末1粗品13.2 g，HPLC法檢測所得1粗品的相對百分含量(純度)非常穩(wěn)定，平均為53.9%。

3.3二氫卟吩e6-C15單甲酯(1)的色譜制備將上述3批1粗品分別用硅膠H柱色譜法分離，以氯仿-丙酮-甲醇-甲酸(10∶1∶1∶0.1，V/V/V/V)洗脫，平均每批得1純品4.8 g(HPLC法檢測純度為98.5%)，反應(yīng)工藝的平均收率為56.5%。

表2　L 9(3 4)正交試驗結(jié)果及極差分析數(shù)據(jù)

表3　方差分析結(jié)果

F0.005 (2,18)=7.21

3討論

本實驗以正交試驗設(shè)計對文獻報道的二氫卟吩e6-C15單甲酯(1)的合成反應(yīng)條件進行優(yōu)化，獲得了最佳反應(yīng)條件B1C2A2D1。在此條件下，以放大量的同一批號脫鎂葉綠酸a(3)粗品15.0 g(HPLC法檢測純度為55%)為原料，進行3次重復(fù)驗證實驗，所得1粗品的相對百分含量(純度)基本一致且相對穩(wěn)定，并與小樣正交試驗優(yōu)選結(jié)果吻合，說明正交試驗優(yōu)選出的合成工藝條件合理且穩(wěn)定可行。與文獻[6]相比，該合成工藝優(yōu)化為“一鍋法”，剔除了易燃溶劑乙醚，減少了堿及甲醇的用量，縮短了開環(huán)反應(yīng)時間，工藝收率也從43.0%提高到56.5%。因此，本實驗結(jié)果為二氫卟吩e6-C15單甲酯(1)較大規(guī)模的制備、分離提供了科學(xué)依據(jù)。

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[本文編輯]李睿旻