HspX的功能及其在結(jié)核疫苗研制中的應(yīng)用進(jìn)展

梁正敏，宋銀娟，董玉慧，屈孟錦，周向梅

結(jié)核病是一個(gè)主要由Mtb引起的慢性傳染性疾病，是全球公共衛(wèi)生的巨大威脅。世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)報(bào)告：2018年，全球約有1 000萬結(jié)核病新發(fā)病例，145.1萬人死于結(jié)核病[1]?？ń槊?Bacillus Calmette-Guerin，BCG)是目前廣泛用于預(yù)防結(jié)核病的疫苗，能預(yù)防兒童結(jié)核病，但不能有效預(yù)防成人結(jié)核病或潛伏性感染結(jié)核[2]。因此，迫切需要開發(fā)出更安全有效的結(jié)核疫苗來控制結(jié)核病的發(fā)生和發(fā)展。目前已有14種候選結(jié)核疫苗正在開展臨床試驗(yàn)[1,3]。其中，蛋白佐劑疫苗和病毒載體疫苗主要以Mtb早期分泌抗原為主。近年來，為了開發(fā)出一種能控制多種類型的結(jié)核，越來越多的研究通過將Mtb早期抗原和晚期抗原相結(jié)合構(gòu)建多階段抗原亞單位疫苗[4]。其中，含潛伏感染抗原的多階段抗原亞單位疫苗已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段[3]。因此，Mtb潛伏感染相關(guān)抗原在新型結(jié)核疫苗的設(shè)計(jì)策略中起著重要作用。

HspX蛋白又稱Acr，HPS16.3，16 kDa抗原，編碼該蛋白的基因稱HspX或acr或Rv2031c，以下簡稱HspX。HspX是Mtb潛伏感染期的主要抗原，是一種有效的分子伴侶，在體外可以保護(hù)蛋白質(zhì)不聚集[5-6]。缺氧或巨噬細(xì)胞的體外感染可誘導(dǎo)HspX的表達(dá)[5,7]。HspX可區(qū)分潛伏感染結(jié)核[8]。此外，HspX特異性IFN-γ，TNF-α 和IL-10可作為活動(dòng)性結(jié)核康復(fù)期宿主對(duì)Mtb反應(yīng)的生物標(biāo)志物[9]。最近研究顯示：用等離子體生物傳感器檢測痰液中的HspX抗原可作為一個(gè)快速診斷結(jié)核病的方法[10]。因此，HspX是一個(gè)具有較大應(yīng)用潛力的診斷抗原。此外，HspX可誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞成熟和產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子[11]，而另一研究報(bào)道只有HspX與ESAT6共刺激時(shí)才能產(chǎn)生這種免疫反應(yīng)[12]，提示ESAT6與HspX共作用可能比單獨(dú)的抗原能誘導(dǎo)更強(qiáng)的免疫反應(yīng)。此外，HspX還可誘導(dǎo)人外周血單核細(xì)胞產(chǎn)生抑炎因子IL-10[9]，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的活化、成熟和分化[13]。研究表明HspX刺激樹突狀細(xì)胞可抑制體內(nèi)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移[11]以及過敏性哮喘反應(yīng)[14]。此外，以HspX為靶標(biāo)的肽抑制劑可作為針對(duì)持續(xù)性結(jié)核病的有效藥物[15]。更重要的是，HspX是一個(gè)重要的新型結(jié)核疫苗候選抗原[16-17]。有研究顯示接種BCG不會(huì)引起T細(xì)胞對(duì)HspX的反應(yīng)[18]。以HspX設(shè)計(jì)的重組BCG疫苗[19-20]、蛋白佐劑疫苗[21-22]、病毒載體疫苗[23]以及DNA疫苗[24-25]在Mtb感染動(dòng)物模型上顯示出較高的免疫原性和保護(hù)性作用。

1 HspX作為毒力因子的作用

HspX是一種被低氧誘導(dǎo)的應(yīng)激蛋白，其表達(dá)受DosR調(diào)節(jié)子控制。HspX與Mtb的持久性[26-27]有關(guān)。HspX的分子伴侶活性對(duì)穩(wěn)定Mtb的細(xì)胞結(jié)構(gòu)起著關(guān)鍵作用，有利于Mtb在巨噬細(xì)胞中的長期生存[5, 28]。缺失HspX基因?qū)е翸tb在體內(nèi)和體外生長加快[26]。因此，HspX參與調(diào)節(jié)細(xì)菌在巨噬細(xì)胞中的長期生存和逃避宿主的免疫反應(yīng)。

1.1HspX的分子伴侶活性 分子伴侶活性是小分子熱休克蛋白(Small heat shock proteins，sHSPs)的一個(gè)重要特征[29]。與其它sHSPs一樣，分枝桿菌的HspX蛋白可在體外表現(xiàn)出分子伴侶特性[5-6]。此外，HspX通過暴露疏水表面[30]和調(diào)節(jié)低聚物的解離率[31]來調(diào)節(jié)其伴侶蛋白的活性以應(yīng)對(duì)環(huán)境的變化。有研究發(fā)現(xiàn)亮氨酸殘基(Leu122)對(duì)HspX的伴侶蛋白的活性至關(guān)重要[32]。ATP[33]和溫度[34]對(duì)其分子伴侶活性影響較大。ATP能明顯提高HspX的伴侶蛋白活性[33]。在一定溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，抑制胰島素聚集的活性越強(qiáng)[34]。高溫100 ℃條件下孵育HspX，也能在不改變表面疏水性的情況下增強(qiáng)伴侶蛋白的活性[35]。因此，HspX可維持Mtb其它蛋白的穩(wěn)定性，有利于Mtb的長期生存[5, 28]。

1.2HspX對(duì)Mtb在休眠期間的存活影響 HspX是Mtb潛伏感染的重要分子，有助于Mtb在長期休眠期間的存活[5, 28, 36]。Mtb進(jìn)入穩(wěn)定期后，HspX的表達(dá)水平增加[5, 37]。過表達(dá)該蛋白的Mtb菌株在穩(wěn)定期的生存能力較野生型Mtb強(qiáng)[5]。細(xì)胞壁增厚和HspX可能是Mtb處于休眠狀態(tài)的標(biāo)志。在微氧或無氧條件下培養(yǎng)的BCG或H37Rv能表達(dá)HspX并可見明顯增厚的細(xì)胞壁外層，表明HspX可通過穩(wěn)定Mtb細(xì)胞結(jié)構(gòu)，形成增厚的細(xì)胞壁來適應(yīng)長期低氧環(huán)境(如肺組織肉芽腫)，有助于Mtb在宿主的惡劣環(huán)境中長期存活[28, 38]。有趣的是，Mtb的HspX的mRNA轉(zhuǎn)錄水平在一定條件下與其蛋白表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)[37]。小鼠感染模型發(fā)現(xiàn)在感染30 d期間，肺臟中HspX的mRNA轉(zhuǎn)錄水平逐漸升高，在感染50 d后顯著下降。在感染早期，HspX轉(zhuǎn)錄的上調(diào)很難解釋，用IFN-γ敲除小鼠研究發(fā)現(xiàn)這些轉(zhuǎn)錄變化受宿主Th1介導(dǎo)的免疫反應(yīng)影響，可能與巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的一氧化氮有關(guān)[39]。有研究表明體外培養(yǎng)的Mtb缺氧時(shí)進(jìn)入非復(fù)制持續(xù)階段導(dǎo)致HspX蛋白的表達(dá)，體內(nèi)感染也是如此[7]。

1.3HspX對(duì)結(jié)核分枝桿菌的生長和毒力的影響 基因敲除研究表明HspX對(duì)Mtb的生長發(fā)揮減緩作用[26-27]。研究表明HspX基因突變菌株在巨噬細(xì)胞和小鼠體內(nèi)生長加快[26, 40]。此外，過表達(dá)HspX的BCG菌株在小鼠肺和肝臟中的生長受到抑制[27]。另一個(gè)研究表明過表達(dá)的HspX在一定程度上保護(hù)衰老細(xì)菌不自溶，這可能歸功于HspX的分子伴侶活性，可以穩(wěn)定細(xì)胞壁和細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)[38]。因此，基于這些發(fā)現(xiàn)，可以確定HspX在減緩Mtb的生長方面發(fā)揮了積極的作用。巨噬細(xì)胞的自噬可有效消除胞內(nèi)Mtb的滯留[41]。有研究表明HspX可抑制巨噬細(xì)胞自噬[42]。因此，HspX是Mtb潛伏感染期的一個(gè)重要毒力因子。

2 HspX在結(jié)核疫苗中的作用

由于BCG有限的保護(hù)力，迫切需要研發(fā)新的有效結(jié)核疫苗。許多Mtb抗原已被用于結(jié)核疫苗的設(shè)計(jì)，其中，HspX是免疫原性最好的Mtb潛伏感染相關(guān)抗原之一。HspX能在結(jié)核感染潛伏期誘導(dǎo)細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)。HspX啟動(dòng)子可促進(jìn)重組BCG快速進(jìn)入樹突狀細(xì)胞[43]。利用HspX啟動(dòng)子構(gòu)建的rBCG:CysVac2免疫小鼠后，可明顯提高免疫原性[44]。多種用HspX構(gòu)建的重組BCG疫苗、蛋白佐劑疫苗、病毒載體疫苗和DNA疫苗已在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物感染模型中進(jìn)行免疫效果評(píng)估(表1)。多項(xiàng)研究表明用HspX與Mtb感染早期抗原相結(jié)合構(gòu)建的多階段抗原亞單位疫苗能誘導(dǎo)抗感染免疫應(yīng)答[22, 24, 45]。但這些疫苗的臨床應(yīng)用有待進(jìn)一步研究。

表1 用HspX構(gòu)建的候選結(jié)核疫苗Tab.1 Candidate tuberculosis vaccines constructed with HspX

2.1重組BCG 由于免疫BCG不會(huì)引起T細(xì)胞對(duì)HspX的反應(yīng)[18]。用HspX構(gòu)建重組BCG可明顯提高BCG的免疫原性和保護(hù)性。rBCG∶∶X能明顯減輕肺組織病理損傷和載菌量，且其免疫保護(hù)作用比過表達(dá)Ag85B菌株更強(qiáng)[19]。此外，研究發(fā)現(xiàn)表達(dá)HspX的DNA疫苗可明顯促進(jìn)rBCG∶∶X的抗Mtb感染保護(hù)作用[38]。rBCG∶∶XB免疫小鼠后能產(chǎn)生比BCG更強(qiáng)、更持久的抗Mtb感染保護(hù)作用[20]。此外，rBCG-CMX可被巨噬細(xì)胞高效吞噬，誘導(dǎo)一氧化氮的產(chǎn)生及Th1和Th17免疫應(yīng)答，降低肺組織中的載菌量，當(dāng)聯(lián)合用重組蛋白CMX加強(qiáng)免疫時(shí)，其免疫保護(hù)作用優(yōu)于BCG[46]。

2.2蛋白佐劑疫苗 由于世界上大多數(shù)人都接種了BCG，在BCG預(yù)免疫的基礎(chǔ)上進(jìn)行加強(qiáng)免疫是一種可行的疫苗設(shè)計(jì)策略。蛋白佐劑疫苗主要用于加強(qiáng)免疫，目前已有4種蛋白佐劑疫苗正在開展臨床試驗(yàn)[3]。用HspX構(gòu)建的蛋白佐劑疫苗尚在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型研究階段，且不同的疫苗設(shè)計(jì)策略產(chǎn)生的免疫保護(hù)作用差異較大。有研究發(fā)現(xiàn)天然的HspX蛋白而不是重組蛋白HspX為小鼠提供抗Mtb感染保護(hù)[51]。此外，另一個(gè)研究顯示3種HspX蛋白(一種天然蛋白和兩種重組蛋白)免疫僅對(duì)HspX缺失的Mtb菌株感染具有保護(hù)作用[52]。然而，有研究表明單獨(dú)的重組蛋白HspX聯(lián)合佐劑CASAC或脂質(zhì)體能增強(qiáng)BCG的抗Mtb感染作用[53-54]。這些結(jié)果提示將HspX作為單一抗原構(gòu)建的蛋白佐劑疫苗可能免疫效果不佳，含多階段抗原的蛋白佐劑疫苗具有更好的免疫原性和保護(hù)性。

有研究發(fā)現(xiàn)重組蛋白Ag85A 與 HspX混合免疫能在不同感染階段誘導(dǎo)抗感染保護(hù)作用，有趣的是，僅Ag85A免疫后能對(duì)感染30 d后的小鼠提供保護(hù)，而HspX不能，但HspX能對(duì)感染90 d的小鼠提供保護(hù)[21]。這與Agatha E等[52]研究結(jié)果不一致，可能與使用不同的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有關(guān)。活躍復(fù)制期抗原Mtb10.4和HspX構(gòu)建的融合蛋白MH能增強(qiáng)BCG的抗Mtb感染作用[45]。但含3種抗原的融合蛋白AMH未能促進(jìn)BCG的免疫保護(hù)作用[55]。而含有4種抗原的融合蛋白LT69被證明低劑量(2 μg)能產(chǎn)生持久的免疫記憶反應(yīng)，并提供有效的抗感染保護(hù)作用[22]。值得一提的是，有研究表明HspX蛋白可被其T細(xì)胞表位所取代用于研制結(jié)核疫苗[56]。將HspX抗原的CD4 T細(xì)胞表位的L91表位疫苗能提供比BCG更強(qiáng)的保護(hù)作用[57]。含TB10.4和HspX的MHC結(jié)合肽的多表位疫苗L4.8能明顯降低Mtb感染小鼠的組織載菌量，保護(hù)作用優(yōu)于BCG和L91[58]。因此，抗原數(shù)量的增加并一定能提供更好的免疫保護(hù)作用，相反，抗原的選擇和組合顯得更加重要。

佐劑對(duì)于結(jié)核蛋白疫苗的作用至關(guān)重要，除了常用的佐劑成分如MPL，DDA，TDM，poly I:C等，一些新的佐劑成分如脂質(zhì)體[59]、芽孢[49]、巴西棕櫚蠟[50]等也加入了新型結(jié)核疫苗的設(shè)計(jì)中。含HspX抗原的脂質(zhì)體微粒可誘導(dǎo)明顯的抗原特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)和體液免疫反應(yīng)，降低小鼠肺組織中的載菌量，增強(qiáng)BCG的抗Mtb感染作用[54, 60]。最近研究發(fā)現(xiàn)用枯草芽孢桿菌的芽孢包被融合蛋白Ag85B-HspX- HBHA(FP1)，呼吸道黏膜免疫后可明顯促進(jìn)BCG的免疫原性和保護(hù)性[49]。用巴西棕櫚蠟包封FP1制備的納米疫苗也能明顯促進(jìn)BCG的免疫原性和保護(hù)性[50]。但這些新型蛋白佐劑疫苗的安全性和免疫原性有待進(jìn)一步的臨床前試驗(yàn)評(píng)估。

2.3病毒載體疫苗 多種病毒載體結(jié)核疫苗正在開展臨床試驗(yàn)[3]，而用HspX構(gòu)建的病毒載體疫苗的相關(guān)研究較少。Prachi等用牛痘病毒載體表達(dá)抗原HspX構(gòu)建病毒載體疫苗rMVA.acr，呼吸道黏膜免疫豚鼠后，能明顯促進(jìn)BCG的免疫原性和抗感染保護(hù)作用，此外，肌肉注射免疫rMVA.acr也能明顯促進(jìn)BCG的保護(hù)作用[23]。

2.4DNA疫苗 相對(duì)于以上3種類型的結(jié)核疫苗，DNA疫苗研究較少。盡管DNA疫苗對(duì)一些病原體產(chǎn)生一定的保護(hù)性免疫，但尚未有被批準(zhǔn)進(jìn)入人類使用的DNA疫苗[61]。迄今為止，也尚未有DNA結(jié)核候選疫苗進(jìn)入臨床試驗(yàn)。為了提高DNA疫苗的免疫原性，Neha等用“DNA-launched” 復(fù)制子構(gòu)建了Vrep-Acr/Ag85B，研究表明Vrep-Acr/Ag85B比常規(guī)編碼相同抗原的DNA疫苗能誘導(dǎo)更持久、更高水平的抗原特異性CD4+和CD8+T細(xì)胞反應(yīng)[62]。此外，表達(dá)Ag85B，ESAT6和HspX的DNA疫苗pAEH免疫小鼠后可明顯增加CD4+和CD8+T細(xì)胞數(shù)目，抑制肺臟和脾臟中Mtb的復(fù)制，其免疫原性優(yōu)于僅表達(dá)HspX的DNA疫苗[25]。盡管如此，這些疫苗未進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

3 小 結(jié)

HspX具有分子伴侶蛋白活性，參與建立Mtb長期感染過程，是潛伏性結(jié)核感染相關(guān)的重要毒力因子。HspX具有較強(qiáng)的免疫原性，與合適的佐劑聯(lián)合使用可誘導(dǎo)抗感染保護(hù)作用。不同的疫苗類型、抗原的組成、佐劑、免疫途徑等因素會(huì)影響疫苗的免疫保護(hù)效果。天然蛋白HspX免疫原性和保護(hù)性比重組蛋白HspX強(qiáng)，但天然抗原蛋白獲取率低、成本高，不宜進(jìn)行批量生產(chǎn)，因此重組蛋白仍然是制備疫苗抗原蛋白的主要技術(shù)手段。由于免疫BCG不能誘導(dǎo)T細(xì)胞對(duì)HspX的反應(yīng)，用HspX聯(lián)合Mtb早期感染抗原構(gòu)建的多階段抗原蛋白佐劑疫苗是一種有潛力的候選疫苗。但這些新型疫苗的安全性和有效性需要進(jìn)一步的臨床研究。

利益沖突：無