輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白自組裝修飾金納米粒子

（蘇州百拓生物技術(shù)服務(wù)有限公司，江蘇蘇州215123）

金納米粒子由于其獨(dú)特的理化性質(zhì)，在納米生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。病毒結(jié)構(gòu)蛋白具有自組裝能力，能把外源納米粒子通過(guò)自組裝包覆到病毒樣顆粒（virus like particles，VLP）的內(nèi)腔中，形成病毒蛋白－納米材料復(fù)合物，并具有粒徑均一、生物相容性好、表面具有豐富的化學(xué)基團(tuán)可供修飾等特點(diǎn)，在納米科學(xué)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景［1］。

在病毒的內(nèi)殼結(jié)構(gòu)蛋白中，與病毒基因組相互作用的肽鏈氨基末端會(huì)伸展出一段帶正電荷的氨基酸，能把很長(zhǎng)的基因組壓縮折疊后包覆到病毒中［2］。利用這種能力，可以把外源治療性基因裝載到VLP中構(gòu)建基因治療載體［3］。除治療性核酸外，人們嘗試了裝載其它具有診療功能的外源物質(zhì)到VLP中，構(gòu)建藥物治療或造影載體，Lewis 等［4］和Leong等［5］利用羧基化熒光基團(tuán)Alexa Fluor 555 與豇豆花葉病毒（cowpea mosaic virus，CPMV）交聯(lián)，構(gòu)建了新生血管的靶向造影系統(tǒng)；Zhao等［6］利用重組表達(dá)的輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP6交聯(lián)阿霉素后進(jìn)行體外組裝，構(gòu)建了肝癌細(xì)胞的靶向藥物輸運(yùn)體系；Everts等［7］通過(guò)共價(jià)交聯(lián)的方式，將金納米粒子交聯(lián)到腺相關(guān)病毒上，構(gòu)建了腫瘤靶向熱療體系；Sun等［8］研究發(fā)現(xiàn)，不同粒徑的金納米粒子能誘導(dǎo)雀麥草花葉病毒（brome mosaic virus，BMV）組裝，誘導(dǎo)病毒蛋白形成不同對(duì)稱結(jié)構(gòu)的VLP。

在將外源性的納米粒子裝載進(jìn)VLP的過(guò)程中，靜電相互作用、納米粒子的形貌和尺寸對(duì)裝載效率影響較大。目前，除金納米粒子外，量子點(diǎn)［9］、四氧化三鐵納米粒子［10］等均是對(duì)納米粒子進(jìn)行仿基因組的負(fù)電修飾，誘導(dǎo)外殼蛋白進(jìn)行組裝，形成納米復(fù)合材料［11－14］。鑒于此，作者采用原核重組表達(dá)的方法，獲得輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP6，利用其內(nèi)腔表面帶負(fù)電荷的特點(diǎn)［15］，用聚乙酰亞胺（polyetherimide，PEI）還原法合成表面帶正電荷的金納米粒子，通過(guò)靜電相互作用誘導(dǎo)VP6進(jìn)行自組裝，獲得VP6包覆的金納米復(fù)合材料，有望為靶向診療、病毒基礎(chǔ)研究等方面提供新思路。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP6基因（GenBank accession number：AY787645），全長(zhǎng)1 356bp，編碼397個(gè)氨基酸，分子量45kDa，來(lái)源于人類A 組輪狀病毒TBChen株；限制性內(nèi)切酶、T4DNA 連接酶，大連寶生物公司。

氯金酸、聚乙烯亞胺（PEI），阿爾法公司。

透射電鏡，F(xiàn)EI公司；檢測(cè)型凝膠電泳儀（7cm×12cm），上海六一儀器廠；聚丙烯酰胺凝膠電泳儀（20 cm×20cm）、紫外可見光譜儀，PE 公司；恒溫?fù)u床，上海一恒；低溫高速離心機(jī)，Thermo；滅菌高壓鍋；細(xì)胞超聲粉碎儀，新芝。

1.2 方法

輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP6 的內(nèi)腔是負(fù)電性的［15］，不和基因組直接相連，而直接接觸結(jié)構(gòu)蛋白VP2?；诖?，作者采用了和其它文獻(xiàn)不同的誘導(dǎo)組裝方式，首先對(duì)金納米粒子進(jìn)行PEI正電修飾，然后誘導(dǎo)VP6圍繞金納米粒子進(jìn)行組裝，如圖1所示。

圖1 VP6組裝修飾金納米粒子示意圖Fig.1 Schematic diagram of gold nanoparticles modified by VP6

1.2.1 金納米粒子的合成［16］

將25 mL 氯金酸（純度99.99%，1.4 mmol·L－1）分別與0.9mL、0.7mL、0.5mL PEI（質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%）混合，得到不同粒徑的金納米粒子，在80 ℃下劇烈攪拌2h，12 000r·min－1離心，水洗2遍，再離心，即得到水溶性的帶正電荷的金納米粒子。金納米粒子的粒徑由反應(yīng)體系的PEI的量控制。

1.2.2 VP6的重組表達(dá)

質(zhì)粒的構(gòu)建和蛋白的表達(dá)［6］：培養(yǎng)的病毒經(jīng)RTPCR 獲得VP6 的編碼基因。在正向引物（5′－ATCATATGGATGTTTGTATTCA－3′）和反向引物（5′－ATCCGCGGAGCTCCACCGCGGTGGC－3′）中分別引入限制性核苷酸內(nèi)切酶位點(diǎn)NdeⅠ和SacⅠ（下劃線）。VP6基因的PCR 產(chǎn)物經(jīng)純化后，用NdeⅠ／SacⅠ雙酶切，制備插入基因片段。插入基因片段和載體基因片段經(jīng)T4DNA 連接酶連接后，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)酶切鑒定，篩選陽(yáng)性菌落，制備攜帶VP6編碼基因的重組表達(dá)質(zhì)粒pET－VP6，并對(duì)其進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定。核苷酸序列測(cè)定證明準(zhǔn)確無(wú)誤后，將pET－VP6轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽(yáng)性菌落接種于LB培養(yǎng)液（含200μg·mL－1氨芐青霉素）于37 ℃（12～16h）培養(yǎng)。8 000r·min－1離心10min，收集菌體，用超聲裂解緩沖溶液（200mmol·L－1NaCl，50 mmol·L－1Tris，5%glycerol，5%Triton X－100，2mmol·L－1EDTA）懸浮，于冰水浴中超聲破碎20 min（超聲5s，暫停5s，功率400 W，超聲探頭直徑10mm），12 000r·min－1離心15min，收集上清，沉淀（主要是包涵體蛋白）先用2 mol·L－1尿素洗滌，然后用8mol·L－1尿素溶解后，分裝保存于－20 ℃冰箱，SDS－PAGE電泳檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物。

蛋白的純化：利用切膠的方法對(duì)蛋白進(jìn)行純化。在裂解產(chǎn)物的沉淀中檢測(cè)到目標(biāo)蛋白，所以可以判斷蛋白以包涵體的形式表達(dá)。包涵體洗滌純化后，溶解在8mol·L－1尿素中。溶解的蛋白經(jīng)SDS－PAGE 凝膠分離（5%濃縮膠，10%分離膠），用150mmol·L－1的KCl顯色，切下VP6所在的條帶，裝入透析袋（截留分子量8 000～14 000kDa）中，透析袋中加入不含SDS的電泳緩沖溶液。電泳（電壓120 V，電流160 mA，4 ℃，3h）透析回收蛋白。電泳完后從透析袋中吸出透析液，裝入另一透析袋中，用聚乙二醇20000濃縮蛋白。Bradford 法測(cè)定蛋白的濃度。甲醇沉淀法除去蛋白中的SDS：取100μL 1mg·mL－1純化蛋白，加甲醇400μL、氯仿100μL、去離子水300μL，漩渦混勻。在12 000r·min－1條件下離心15min，此時(shí)蛋白在氯仿和甲醇／水相的分界處。輕輕吸去上清，加400μL甲醇，混勻，12 000r·min－1離心5min。此時(shí)蛋白沉降到管底，棄上清，加400μL 甲醇漂洗，12 000 r·min－1離心15 min。打開管蓋，使甲醇自然揮發(fā)干，用8mol·L－1尿素溶解蛋白。

蛋白的復(fù)性：利用稀釋－透析法對(duì)蛋白進(jìn)行復(fù)性。將純化的VP6蛋白溶液稀釋到2mg·mL－1，加入到篩選出的復(fù)性液中，8 ℃復(fù)性24h，依次在1 mol·L－1、0.5mol·L－1和0mol·L－1（含50mmol·L－1Tris－HCl）的尿素復(fù)性液中進(jìn)行透析復(fù)性，每次24h，最后用水進(jìn)行透析，除去Tris－HCl。復(fù)性結(jié)束后將透析袋放入聚乙二醇20000中濃縮，12 000r·min－1離心去除沉淀。用蛋白分析試劑盒（Pierce）計(jì)算復(fù)性效率。

1.2.3 VP6包覆的金納米復(fù)合材料的誘導(dǎo)組裝

室溫下，按n（金）∶n（VP6）＝1∶20在碳酸鈉－碳酸緩沖溶液（0.02mol·L－1，pH 值5.5）中誘導(dǎo)16h進(jìn)行組裝。

組裝完成后于12 000r·min－1離心30min，水洗2次，用2%磷鎢酸染色，進(jìn)行透射電鏡表征。

2 結(jié)果與討論

2.1 金納米粒子的紫外可見光譜分析

25mL氯金酸分別與0.9 mL、0.7 mL、0.5 mL PEI混合得到不同粒徑的金納米粒子，其紫外可見光譜見圖2。

由圖2 可知，隨著PEI用量的減少，金納米粒子的最大紫外吸收峰從528nm 紅移到了533nm。

2.2 VP6蛋白的SDS－PAGE分析

圖2 不同粒徑金納米粒子的紫外可見光譜Fig.2 UV－Vis Spectra of gold nanoparticles with different particle sizes

采用SDS－PAGE檢測(cè)表達(dá)和純化的VP6，結(jié)果見圖3。

圖3 表達(dá)（a）和純化（b）的VP6的SDS－PAGE電泳圖譜Fig.3 SDS－PAGE Electrophorogram of expressed（a）and purified（b）VP6

由圖3可看出，VP6蛋白在大腸桿菌BL21（DE3）中獲得了高效表達(dá)（條帶2），主要以包涵體的形式存在（條帶3）。用SDS－PAGE 電泳對(duì)洗滌后的包涵體進(jìn)行進(jìn)一步的純化，將目的條帶從膠上切下，經(jīng)電泳回收后，用SDS－PAGE電泳檢測(cè)純化結(jié)果（條帶4）。經(jīng)復(fù)性后，采用Bradford法，通過(guò)蛋白分析試劑盒對(duì)復(fù)性效率進(jìn)行計(jì)算：先用蛋白分析試劑盒制作牛血清白蛋白（BSA）的標(biāo)準(zhǔn)曲線并得到擬合方程，測(cè)定復(fù)性后的蛋白濃度，計(jì)算得到復(fù)性效率為32.38%。

2.3 VP6自組裝修飾金納米粒子的TEM 分析

將紫外吸收波長(zhǎng)為533nm 的金納米粒子與VP6混合，使VP6以金納米粒子為核進(jìn)行組裝，組裝完成后進(jìn)行TEM 表征，結(jié)果見圖4。

由圖4可看出，金納米粒子成功地對(duì)VP6進(jìn)行了誘導(dǎo)組裝，該組裝方式主要是靠靜電相互作用完成，即VP6上的負(fù)電荷和金納米粒子表面的正電荷作用后進(jìn)行組裝。

圖4 金納米粒子（a）及VP6自組裝修飾金納米粒子（b）的TEM 照片F(xiàn)ig.4 TEM Images of gold nanoparticles（a）and VP6 self－assembly modified gold nanoparticles

3 結(jié)論

通過(guò)輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP6自組裝的方式對(duì)金納米粒子進(jìn)行了修飾，獲得了VP6包覆的金納米復(fù)合材料。一方面，VP6蛋白的修飾可以改善金納米粒子的生物相容性、分散性，并使其表面攜帶上豐富的化學(xué)基團(tuán)（如氨基、羧基、巰基），方便進(jìn)一步的化學(xué)修飾；另一方面，功能化的金納米粒子也可以改變VP6蛋白的組裝方式，如打破病毒的天然組裝，使其組裝成其它對(duì)稱結(jié)構(gòu)的VLP，這樣的改變可能不止在癌癥的診斷和治療中有著潛在應(yīng)用，在病毒本身的機(jī)制研究方面，如組裝、感染途徑、疫苗研究等方面也有可能帶來(lái)潛在運(yùn)用。

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