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    四臂星型生物素化聚乙二醇-聚丙交酯的合成與性能研究

    2015-12-28 05:42:48
    化學(xué)與生物工程 2015年3期
    關(guān)鍵詞:星型鏈段生物素

    (山東省藥學(xué)科學(xué)院山東省醫(yī)用高分子材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東濟(jì)南250101)

    聚丙交酯(PLA)由于其優(yōu)良的生物降解性、生物相容性及安全性,一直被視為一種具有優(yōu)越應(yīng)用前景的醫(yī)用可降解高分子材料,其作為藥物控釋載體方面的應(yīng)用一直是近年來的研究熱點(diǎn)[1]。但由于PLA 的疏水性,其在體內(nèi)與細(xì)胞的相容性較差,容易被體內(nèi)的巨噬細(xì)胞吞噬。此外,PLA 作為藥物載體也不具有主動(dòng)靶向性。因而,對(duì)其進(jìn)行親水性改性和靶向修飾的研究非常多[2-4]。使用改性和修飾的PLA 作為藥物載體可以大大提高藥物的生物利用度,降低藥物的毒副作用。相對(duì)于線性PLA,多支化、星型PLA 分子表面有高密度的官能團(tuán)且內(nèi)部易形成大量的空腔,使藥物分子可以物理包封于聚合物的內(nèi)部空腔中,從而提高藥物的包載率[5]。

    生物素-親和素系統(tǒng)(biotin-avidin system,BAS)是20世紀(jì)70年代末發(fā)展起來的一種新型生物反應(yīng)放大系統(tǒng),具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性高的特點(diǎn)[6-7]。目前,通過BAS介導(dǎo)的腫瘤靶向治療已成為最新研究熱點(diǎn)之一。將藥物或藥物載體進(jìn)行生物素化,與含有生物素的抗體通過親和素的橋連作用而連接,然后通過抗體-抗原間的特異識(shí)別作用,便可以實(shí)現(xiàn)對(duì)靶細(xì)胞的定向輸送[8-9]。

    作者合成了一種四臂星型生物素化聚乙二醇-聚丙交酯嵌段共聚物[PET-(PLA-PEG-biotin)4],并對(duì)其化學(xué)結(jié)構(gòu)和性能進(jìn)行了研究。擬為其作為一種新型的靶向藥物載體的研究和應(yīng)用提供參考。合成路線如圖1所示。

    圖1 四臂星型生物素化聚乙二醇-聚丙交酯的合成路線Fig.1 The synthetic route of 4-arms star polymer PET-(PLA-PEG-biotin)4

    1 實(shí)驗(yàn)

    1.1 試劑

    丙交酯(LA,左旋,純度≥99.5%),參照文獻(xiàn)[10]自制;季戊四醇(PET),分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;辛酸亞錫,分析純,Sigma 公司;聚乙二醇(PEG,分子量1 500g·mol-1),EHSY 公司;丁二酸酐(SA),分析純,天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司;三乙胺(TEA),分析純,天津科密歐化學(xué)試劑有限公司;二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、生物素,純度≥99%,上海源葉生物科技有限公司;氯仿,色譜純,美國(guó)JT Baker公司;乙醇、二氯甲烷、二甲基亞砜,分析純,天津廣成化學(xué)試劑公司。

    1.2 四臂星型生物素化聚乙二醇-聚丙交酯的合成

    1.2.1 四臂星型聚丙交酯-聚乙二醇嵌段共聚物[PET-(PLA-PEG)4]的合成

    PET-PLA4的合成:將一定量的PET 置于反應(yīng)瓶中,加入0.2%(以單體質(zhì)量計(jì))的辛酸亞錫,然后加入一定質(zhì)量的LA,在150 ℃、70 Pa 下磁力攪拌反應(yīng)24h,產(chǎn)物用二氯甲烷溶解后用乙醇沉淀純化,50 ℃真空干燥48h。

    羧基化PET-PLA4的合成:稱取一定量的PETPLA4和丁二酸酐(物質(zhì)的量比1∶4.5),加入適量三乙胺及4-二甲氨基吡啶,溶于一定量的二甲基亞砜中,室溫下反應(yīng)24h,產(chǎn)物于無水乙醇中沉淀洗滌3次,真空干燥48h。

    PET-(PLA-PEG)4的合成:稱取一定量的羧基化PET-PLA4和PEG(物質(zhì)的量比1∶4),加入適量二環(huán)己基碳二亞胺和4-二甲氨基吡啶,溶于二氯甲烷中,40 ℃磁力攪拌反應(yīng)24h,產(chǎn)物于無水乙醇中沉淀,40℃真空干燥48h。

    1.2.2 琥珀酰亞胺生物素酯(biotin-NHS)的合成

    稱取一定量的生物素和N-羥基琥珀酰亞胺(物質(zhì)的量比1∶1.2),加入二環(huán)己基碳二亞胺,以二甲基甲酰胺為溶劑,置于80℃油浴中磁力攪拌至完全溶解后于室溫下繼續(xù)攪拌反應(yīng)24h。產(chǎn)物于冷的異丙醇中沉淀,抽濾得白色粉末,然后再溶于二甲基甲酰胺中,重結(jié)晶2次,產(chǎn)物于40 ℃真空干燥48h。

    1.2.3 四臂星型生物素化聚乙二醇-聚丙交酯[PET-(PLA-PEG-biotin)4]的合成

    稱取一定量的PET-(PLA-PEG)4和biotin-NHS(物質(zhì)的量比1∶1.2),加適量二甲基亞砜溶解,通氮?dú)獗Wo(hù),40 ℃磁力攪拌反應(yīng)48h。產(chǎn)物于無水乙醇中沉淀,40 ℃真空干燥48h,得白色粉末狀固體。

    1.3 表征方法

    以CDCl3為溶劑,采用德國(guó)Bruker Avance 400 MHz型核磁共振儀測(cè)定聚合物的核磁圖譜;采用美國(guó)Waters 2414型凝膠滲透色譜儀(GPC)測(cè)定聚合物的重均分子量、數(shù)均分子量及分子量分布系數(shù),氯仿為流動(dòng)相,聚苯乙烯為標(biāo)準(zhǔn)品,流速1.0mL·min-1,測(cè)試溫度30℃;采用日本島津DSC60型示差掃描量熱儀測(cè)定聚合物的熱性能,升溫速率10 ℃·min-1;采用瑞士Krüss公司Krüss-K12型程序界面張力儀測(cè)定聚合物靜態(tài)水接觸角。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 嵌段共聚物的結(jié)構(gòu)表征

    2.1.1 PET-PLA4與PET-(PLA-PEG-biotin)4的核磁共振氫譜(圖2)

    圖2 PET-PLA4(a)與PET-(PLA-PEG-biotin)4(b)的核磁共振氫譜Fig.2 1 HNMR Spectra of PET-PLA4(a)and PET-(PLA-PEG-biotin)4(b)

    在PET-PLA4的圖譜(圖2a)中:5.1~5.2ppm處是PLA 鏈段上次甲基的質(zhì)子峰;1.5~1.6ppm 處是PLA 的甲基質(zhì)子峰;4.2ppm 處的小峰是與丙交酯聚合后的季戊四醇分子上亞甲基的質(zhì)子峰。

    在PET-(PLA-PEG-biotin)4的圖譜(圖2b)中:PLA 鏈段上的甲基和次甲基的質(zhì)子峰位置與PETPLA4一致;3.65ppm 處是PEG 鏈段上亞甲基的質(zhì)子峰;而4.2ppm 和4.5ppm 處的小峰分別為生物素分子上與亞胺基相鄰的兩個(gè)次甲基的特征峰。

    從PET-PLA4的圖譜中可以看出,原季戊四醇的亞甲基在3.45ppm 處的特征峰消失,與丙交酯聚合后其亞甲基峰位移至4.2ppm 處,說明季戊四醇與丙交酯反應(yīng)完全。通過4.2ppm 處季戊四醇亞甲基質(zhì)子峰面積與1.5~1.6ppm 處PLA 鏈段甲基的質(zhì)子峰面積之比,推算得出所合成的PET-PLA4的數(shù)均分子量約為17 000g·mol-1。從PET-(PLA-PEG-biotin)4的圖譜中生物素相應(yīng)的質(zhì)子峰面積與PEG 和PLA 的質(zhì)子峰面積的比例,可以推算出生物素的接枝率為4.43%,此接枝率遠(yuǎn)高于同分子量的線性聚合物。

    2.1.2 PET-PLA4與PET-(PLA-PEG-biotin)4的分子量

    凝膠滲透色譜測(cè)定結(jié)果表明,PET-(PLA-PEGbiotin)4的分子量高于PET-PLA4,PET-PLA4的數(shù)均分子量為18 498g·mol-1,稍大于核磁推算的理論值17 000g·mol-1,其重均分子量為31 674g· mol-1,PDI 為1.712。而PET-(PLAPEG-biotin)4的為23 872g·mol-1,略小于核磁理論推算值23 896g·mol-1,其為43 957g·mol-1,PDI為1.841,分子量分布較窄。該測(cè)量結(jié)果與核磁推算結(jié)果基本一致,兩者數(shù)值上的差異主要源于兩種測(cè)試方法的不同及系統(tǒng)本身的誤差。

    2.2 嵌段共聚物的熱性能分析

    PET-PLA4和PET-(PLA-PEG-biotin)4的示差掃描量熱曲線如圖3所示。

    從圖3可以看出:PET-PLA4僅在160 ℃左右有一明顯的吸熱峰,這是聚丙交酯的熔融峰;PET-(PLA-PEG-biotin)4在相同溫度下也有一吸熱峰,是共聚物中聚丙交酯鏈段的熔融引起的,除此以外,共聚物在45 ℃左右還有一較小的吸熱峰,與PEG 的熔融溫度一致,而生物素由于熔融溫度高,且相對(duì)含量低,在DSC譜圖中未有表現(xiàn)。

    圖3 PET-PLA4 與PET-(PLA-PEG-biotin)4 的示差掃描量熱曲線Fig.3 DSC Curves of PET-PLA4and PET-(PLA-PEG-biotin)4

    2.3 嵌段共聚物的親水性分析

    PET-PLA4和PET-(PLA-PEG-biotin)4的靜態(tài)水接觸角圖片如圖4所示。

    圖4 PET-PLA4 與PET-(PLA-PEG-biotin)4 的靜態(tài)水接觸角圖片F(xiàn)ig.4 Static water contact angle images of PET-PLA4and PET-(PLA-PEG-biotin)4

    由圖4可知,PET-PLA4的靜態(tài)水接觸角明顯大于PET-(PLA-PEG-biotin)4。接觸角越大,說明其親水性越差,可知PET-(PLA-PEG-biotin)4的親水性優(yōu)于PET-PLA4。在共聚物結(jié)構(gòu)單元中,PLA 鏈段及生物素分子都是疏水性的,而PEG 為親水性,說明PEG的引入明顯改善了材料表面的親水性。

    3 結(jié)論

    以季戊四醇為引發(fā)劑,合成了四臂星型聚丙交酯,然后與聚乙二醇反應(yīng),合成了四臂星型聚丙交酯-聚乙二醇共聚物[PET-(PLA-PEG)4],最后生物素活化后與共聚物末端羥基反應(yīng),合成了四臂星型生物素化聚乙二醇-聚丙交酯[PET-(PLA-PEG-biotin)4]。核磁表征發(fā)現(xiàn),PET-(PLA-PEG-biotin)4四臂星型結(jié)構(gòu)大大提高了生物素的接枝率;凝膠滲透色譜測(cè)定表明,其分子量分布較窄;DSC 測(cè)試表明,其熱性能和PETPLA4不同;靜態(tài)水接觸角測(cè)試表明其親水性有明顯改善。

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