大港油田產(chǎn)出水中微生物對正構(gòu)烷烴的降解

（北京科技大學(xué)土木與環(huán)境工程學(xué)院，北京100083）

隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展，世界各國對石油的需求量日益增大。然而，石油在給人類社會發(fā)展帶來巨大推動作用的同時，也增加了對環(huán)境的污染。據(jù)報道，當(dāng)前世界石油年產(chǎn)量約22 億t，但有800 萬t進入環(huán)境。我國石油年產(chǎn)量已超過1 億t，每年新污染土壤10萬t［1］。石油中含量最高的成分是各種鏈長的烷烴，特別是C8～C40的正構(gòu)烷烴［2］。自20世紀80年代以來，生物修復(fù)以其無污染、費用低、效果好逐漸成為石油污染土壤修復(fù)的重要手段［3］。自然界中存在的能夠降解烷烴的微生物約有100余屬、200多種，分屬于細菌、放線菌、霉菌、酵母等［4］。目前，篩選能夠高效降解烷烴的微生物是研究的熱點［5－7］。但單菌只能降解特定類型的烷烴，難以對石油中所有烷烴達到很好的降解效果。油田產(chǎn)出水中存在大量能夠降解烷烴的微生物，通過對菌群進行活化可以提高烷烴的降解效果。

生物體內(nèi)的各種代謝過程都伴隨著能量的轉(zhuǎn)移和熱變化。采用一般的檢測手段很難獲得滿意的結(jié)果，而微量量熱儀具有較高靈敏度（0.1μW）［8－9］，可連續(xù)檢測生物代謝過程所產(chǎn)生的熱量，對微生物的代謝活性進行實時、在線、原位的監(jiān)測。

作者在此分別以十二烷、十六烷、原油為唯一碳源，測定大港油田3口油井產(chǎn)出水中微生物對正構(gòu)烷烴的降解率，同時對產(chǎn)出水中微生物的代謝熱進行測定，進而分析代謝熱和降解率之間的相關(guān)性。

1 實驗

1.1 材料、試劑、培養(yǎng)基與儀器

油田產(chǎn)出水分別采自天津大港油田孔店區(qū)塊1032－4、1032－1、1050－2油井；原油取自大港油田三次采油工藝研究所。

正十二烷、正十六烷，分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

LB液體培養(yǎng)基；葡萄糖培養(yǎng)基；無機鹽培養(yǎng)基（g·L－1）：（NH4）2SO43，KH2PO40.5，Na2HPO4·12H2O 1.26，MgSO4·7H2O 0.54，微量元素液1 mL，pH 值7.0。

TOC－V 型總有機碳分析儀；AA－6300C型火焰原子吸收儀；QP2010型GC－MS分析儀，日本島津公司；TAM（Ⅲ）型微量量熱儀，美國TA 儀器公司；PHS－3C型pH 計，上海雷磁公司。

1.2 產(chǎn)出水的理化性質(zhì)測定

分別取3口油井的產(chǎn)出水150mL，過0.22μm 濾膜，取濾液進行理化性質(zhì)測定。產(chǎn)出水的pH 值用pH計測定；產(chǎn)出水中Na＋、Ca2＋、Mg2＋的含量用原子吸收儀測定；總有機碳（TOC）和總氮（TN）的含量用總有機碳分析儀測定；總磷（TP）的含量用鉬酸銨法測定。

1.3 產(chǎn)出水中微生物的代謝熱測定

采用微量量熱法測定：設(shè)定微量量熱儀溫度為28 ℃。在無菌操作條件下向安瓿瓶中加入2 mL LB液體培養(yǎng)基和10μL產(chǎn)出水，密封，放入微量量熱儀中測定代謝熱，以時間為橫坐標、產(chǎn)熱功率為縱坐標繪制新陳代謝曲線。

在微生物的指數(shù)生長期，產(chǎn)熱功率Pt與生長速率常數(shù)k之間有公式：

式中：P0、Pt分別為指數(shù)生長期初始和t時刻的產(chǎn)熱功率。根據(jù)式（1）進行線性擬合，即可得到生長速率常數(shù)k，該常數(shù)是反映微生物繁殖速度的重要指標。

1.4 產(chǎn)出水中微生物對正構(gòu)烷烴的降解實驗

分別以十二烷、十六烷、原油為碳源，對3口油井產(chǎn)出水中微生物降解烷烴的能力進行研究。原油添加量為0.1%（質(zhì)量濃度），十二烷、十六烷添加量為0.2%（體積分數(shù)）。依次添加1%的葡萄糖培養(yǎng)基對產(chǎn)出水進行活化，待OD600值為0.5左右時進行接種，接種量為2%，然后密封瓶塞減少烷烴的揮發(fā)。以不加菌液作為空白對照組，培養(yǎng)振蕩條件為30 ℃、160r·min－1。

1.5 降解率測定

分別測定烷烴在第5d、第10d的降解率和原油在第10d的降解率。取10mL 正己烷與50mL菌液充分混合，靜置10min后分別收集上層有機相和下層水相。重復(fù)此操作2次，合并有機相，棄下層水相。將有機相過無水硫酸鈉柱除去水分，蒸發(fā)濃縮至2mL，進行GC－MS分析，按式（2）計算降解率（ω）：

式中：c0為空白烷烴的質(zhì)量濃度，通過內(nèi)標與正構(gòu)烷烴的峰面積比值計算；c1為培養(yǎng)液中殘留的烷烴質(zhì)量濃度。

GC－MS條件：進樣口無分流模式，溫度300 ℃；Rtx－5MS型彈性石英毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25μm）；載氣（氦氣）流速為1.2 mL·min－1；爐溫60 ℃保持1min，以15 ℃·min－1升到150 ℃，再以6 ℃·min－1升到320 ℃保持10min。

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)出水的理化性質(zhì)（表1）

從表1可以看出：3口油井產(chǎn)出水為中性或微偏堿性，pH 值差異不大；3口油井產(chǎn)出水中的總有機碳含量相近；1032－4井產(chǎn)出水中的總氮含量最高，達到8.54mg·L－1；1050－2井產(chǎn)出水中的總磷含量最低，僅為0.33mg·L－1；由于油藏為高礦化環(huán)境，對應(yīng)的金屬離子含量普遍較高，其中Na＋的含量最高，均在1 000mg·L－1左右。

表1 產(chǎn)出水的理化性質(zhì)／（mg·L－1）Tab.1 The physical and chemical properties of produced water／（mg·L－1）

2.2 產(chǎn)出水的能量代謝

用微量量熱儀測得的產(chǎn)出水中微生物的新陳代謝曲線如圖1所示，部分微量熱參數(shù)見表2。

圖1 產(chǎn)出水中微生物的新陳代謝曲線Fig.1 The metabolism curves of microorganism in different produced water

表2 產(chǎn)出水的微量熱參數(shù)Tab .2 The microcalorimetric parameters of produced water

由圖1和表2可看出：1032－4井產(chǎn)出水總產(chǎn)熱量、最大產(chǎn)熱功率均最低，在125h之前微生物幾乎沒有生長，125h之后開始迅速生長，在138h達到最大產(chǎn)熱功率（圖1c）；1050－2井產(chǎn)出水總產(chǎn)熱量較高，培養(yǎng)18h后達到最大產(chǎn)熱功率429.40μW，微生物代謝活躍，之后隨著氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的耗竭，菌體逐漸死亡（圖1a）；1032－1井產(chǎn)出水總產(chǎn)熱量最高，但是生長速率常數(shù)較小，在測量期間生長較平緩，生長周期長（圖1b）。由此可知，3口油井產(chǎn)出水中的微生物在能量代謝方面存在較大差異，說明產(chǎn)出水中的微生物數(shù)量及種類存在差異。

另外，1050－2井產(chǎn)出水中微生物的生長速率常數(shù)最大，1032－4井次之，1032－1井最?。ū?）。1050－2井微生物的出峰時間最早，1032－4井的出峰時間相對較晚（圖1），可能是由于代謝過程后期厭氧微生物被激活，整體活性升高。

2.3 正構(gòu)烷烴的降解實驗

2.3.1 正構(gòu)烷烴的降解效果

分別以十二烷、十六烷為碳源，考察3口油井產(chǎn)出水中的微生物對其降解效果，烷烴在第5d、第10d的降解率見圖2。

圖2 正構(gòu)烷烴在第5d、第10d的降解率Fig.2 The degradation rate of n－alkanes after incubation for 5dor 10d

由圖2可看出：3口油井產(chǎn)出水中的微生物均能較好地降解烷烴；其中，1050－2 井產(chǎn)出水在以十六烷為唯一碳源的培養(yǎng)基中經(jīng)過短暫的適應(yīng)期，菌群迅速生長，培養(yǎng)液很快呈現(xiàn)渾濁，經(jīng)過5d的培養(yǎng)，十六烷降解率達到80%，第10d降解率高達96.65%，且對十二烷的降解效果更好，10d的降解率達到98.67%；1032－4井產(chǎn)出水中的微生物對十六烷、十二烷的降解能力相對最小，10d的降解率均為85%左右。

2.3.2 原油的降解效果

以原油為碳源，考察3口油井產(chǎn)出水的微生物對其降解效果，降解產(chǎn)物（m／z＝85）的離子色譜見圖3。

圖3 降解產(chǎn)物（m／z＝85）的離子色譜Fig.3 Ion chromatograms of the degradation products（m／z＝85）

選取不易被生物降解的藿烷（m／z＝191）作為生物標志物對原油中烷烴在第10d的降解情況進行分析［10］，結(jié)果見圖4。

圖4 原油中正構(gòu)烷烴在第10d的降解率Fig.4 The degradation rate of n－alkanes in crude oil after incubation for 10d

由圖4可看出：3口油井產(chǎn)出水中微生物對原油的平均降解率分別為74.35%、77.45%、81.07%；不僅對短鏈烷烴具有很好的降解效果，對C20以上的烷烴依然具有60%以上的降解率；3口油井產(chǎn)出水中微生物為混合菌群，擁有能夠降解各種鏈長烷烴的優(yōu)勢菌株，因此其對烷烴的利用不局限于專一鏈長的烷烴；而單菌只能利用特定的底物，不能實現(xiàn)對其它烷烴的降解。與之前降解指定烷烴（十二烷和十六烷）的結(jié)果相似，1050－2井產(chǎn)出水中微生物對原油中烷烴的降解能力最強，1032－4井的最弱。

2.4 相關(guān)性分析

為研究3口油井產(chǎn)出水中微生物對正構(gòu)烷烴降解率的影響，分析了各因素之間的相關(guān)性，如表3所示。

表3 各因素之間的相關(guān)性分析Tab.3 The correlation analysis among different parameters

由表3可知：（1）產(chǎn)出水能量代謝與降解率之間存在顯著的正相關(guān)，代謝活躍的微生物對烷烴的降解率最大，特別是最大產(chǎn)熱功率，相關(guān)性系數(shù)均達到0.96以上，表明代謝活性高的樣品更能有效地利用烷烴［11］；（2）TOC、TN、TP的含量與降解率呈負相關(guān)，表明產(chǎn)出水中高有機質(zhì)含量抑制了微生物的活性；（3）Na＋、Ca2＋、Mg2＋的濃度與降解率均呈正相關(guān)，表明當(dāng)前離子濃度沒有對產(chǎn)出水中微生物產(chǎn)生明顯的抑制作用，說明現(xiàn)有的油藏條件適合培養(yǎng)高效的烷烴降解菌株，有利于現(xiàn)場的微生物修復(fù)技術(shù)的開展。

3 結(jié)論

對大港油田3口油井產(chǎn)出水中的微生物進行能量代謝研究，結(jié)果表明，1050－2井產(chǎn)出水中微生物的產(chǎn)熱功率最高，為429.40μW，生長速率常數(shù)最大，為0.49h－1。1050－2井產(chǎn)出水中微生物對十二烷、十六烷的10d降解率分別達到98.67%、96.65%，對原油中烷烴的降解效果也高于其它產(chǎn)出水，其中對C12～C35的正構(gòu)烷烴降解率可達81.07%。相關(guān)性分析證實了代謝活性高的微生物能有效降解烷烴，同時也發(fā)現(xiàn)高有機質(zhì)的環(huán)境不利于降解烷烴的微生物的生存。

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