A族鏈球菌M蛋白相關(guān)疫苗的研究進(jìn)展

袁 婷，關(guān)曉菲（綜述），馬翠卿（審校）

（河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，河北省重大疾病免疫機(jī)制及干預(yù)重點實驗室，河北石家莊050017）

A族鏈球菌M蛋白相關(guān)疫苗的研究進(jìn)展

袁 婷，關(guān)曉菲（綜述），馬翠卿*（審校）

（河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，河北省重大疾病免疫機(jī)制及干預(yù)重點實驗室，河北石家莊050017）

釀膿鏈球菌；疫苗；綜述文獻(xiàn)

A族鏈球菌（group A streptococcus，GAS）也稱化膿性鏈球菌，是最常見的也是致病性最強(qiáng)的革蘭陽性菌之一，其可以引起多種感染性疾病如扁桃體炎、急性咽炎、喉炎、風(fēng)濕熱、猩紅熱及嚴(yán)重的毒性休克綜合征。值得關(guān)注的是GAS感染后還可以導(dǎo)致嚴(yán)重的變態(tài)反應(yīng)性疾病如風(fēng)濕性心臟病、急性腎小球腎炎等。國內(nèi)外從來沒有停止過對GAS疫苗的研究，主要聚焦于免疫原性強(qiáng)的M蛋白，現(xiàn)就以M蛋白為基礎(chǔ)的疫苗研究進(jìn)展綜述如下。

1 GAS的流行病學(xué)

GAS廣泛存在于自然界、健康人的咽喉部以及人和動物的糞便中，通過空氣、皮膚接觸等方式傳播。據(jù)世界衛(wèi)生組織報道，全球每年約有517 000例患者死于鏈球菌感染所致的各種疾病，其中約30%死于鏈球菌的侵襲性感染，近70%死于鏈球菌感染后所致的風(fēng)濕熱、風(fēng)濕性心臟病、急性腎小球腎炎等疾病［1］。我國廣東省、吉林省、浙江省、湖北省及重慶市學(xué)齡兒童GAS年平均感染率為50%，部分農(nóng)村地區(qū)GAS感染率高達(dá)70%～80%，GAS上呼吸道感染導(dǎo)致的風(fēng)濕性心臟病在5個省市兒童中平均發(fā)病率達(dá)22／10萬［2］。

目前，治療GAS感染的主要措施為應(yīng)用抗生素如青霉素、大環(huán)內(nèi)脂類藥物，或靜脈注射免疫球蛋白。雖然沒有報道顯示GAS對青霉素有耐藥性，但相關(guān)研究證實青霉素在GAS咽炎的治療中失敗率達(dá)20%～40%［3］。而對大環(huán)內(nèi)酯類敏感的GAS會利用生物膜形成隔離，成為逃避抗生素治療的機(jī)制從而在宿主體內(nèi)殘留［4］。嚴(yán)重的GAS侵襲性感染，如鏈球菌毒性休克綜合征和壞死性筋膜炎，靜脈內(nèi)注射免疫球蛋白以促進(jìn)調(diào)理吞噬作為輔助治療手段，收到一定的療效，但免疫球蛋白的弊端是只能提供短期保護(hù)。就目前形勢來看，GAS感染已成為臨床治療中的棘手問題。所以，對于GAS的有效防治，除了控制傳染源外，應(yīng)用疫苗成為最有效的措施。

2 GAS疫苗中有效成分的選擇

關(guān)于GAS疫苗的研究是基于鏈球菌的各種蛋白及成分，如M蛋白、C5a肽酶、外毒素B、A族碳水化合物、鏈球菌纖連蛋白結(jié)合蛋白1（streptococcal fibronectin binding protein 1，Sfb1）、血清不透明因子（serum opacity factor，SOF）和纖連蛋白結(jié)合蛋白54（fibronectin binding protein 54，F(xiàn)BP54）等構(gòu)建并制備的亞單位疫苗，但因各種原因，迄今為止仍然沒有安全有效的GAS疫苗供人類使用［5－6］。最近一個時期，對GAS疫苗的研制進(jìn)入了新時代。通過計算機(jī)輔助，利用反向疫苗學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、生物信息學(xué)、全基因測序和DNA微陣列等先進(jìn)技術(shù)，能快速發(fā)現(xiàn)并推斷毒力因子、表面相關(guān)蛋白和可能的候選疫苗。但GAS疫苗的發(fā)展仍然面臨著挑戰(zhàn)性。導(dǎo)致這一現(xiàn)象的原因可歸結(jié)為3個：①GAS的血清型眾多，而它們之間又很少存在交叉，很難制備針對所有流行菌株的疫苗；②缺乏合適有效的動物模型加以評價也是限制疫苗發(fā)展的原因之一；③在GAS疫苗應(yīng)用中，最大的障礙是GAS某些免疫原性強(qiáng)的表面蛋白如M蛋白，與人體組織蛋白存在交叉反應(yīng)，使得疫苗的應(yīng)用面臨著誘發(fā)自身免疫病的風(fēng)險。20世紀(jì)60年代末期，在使用天然的M蛋白制備疫苗試驗中發(fā)現(xiàn)［7］，接種疫苗組較對照組兒童風(fēng)濕熱的發(fā)病率明顯增加。但是，其他GAS蛋白亞單位疫苗所誘發(fā)的免疫應(yīng)答及預(yù)防作用都不及M蛋白，故到目前為止，M蛋白依然是GAS亞單位疫苗研究的重要的備選蛋白，但顯然對于GAS疫苗的研究策略有待改善。

3 M蛋白

M蛋白是GAS所有血清型都表達(dá)的一個重要致病因子。它是GAS細(xì)胞壁的蛋白抗原成分，以二聚體形式存在，由2條多肽鏈復(fù)合成一條α-螺旋卷曲固定在細(xì)胞表面，每條多肽鏈包含多達(dá)4個重復(fù)區(qū)域（記為A～D）。C-端為高度保守區(qū)，N-端通常是由一個高變區(qū)A區(qū)和一個半可變區(qū)B區(qū)構(gòu)成（圖1）。

圖1 M蛋白結(jié)構(gòu)示意圖

M蛋白是GAS抗吞噬作用的主要決定因素?；贛蛋白高變區(qū)的抗原特異性（Lancefield血清學(xué)分類法），已經(jīng)確定的M蛋白血清型至少有150種。M蛋白不同區(qū)段的抗原異質(zhì)性使其呈現(xiàn)出不同的功能，M蛋白的N端高變區(qū)可結(jié)合H因子、H因子樣蛋白和C4bp結(jié)構(gòu)，C-端保守區(qū)也可結(jié)合H因子，這些因子均是經(jīng)典補(bǔ)體途徑的調(diào)節(jié)因子，有助于抗吞噬作用，故GAS通過M蛋白結(jié)合補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白以干擾補(bǔ)體介導(dǎo)的調(diào)理吞噬作用。另外，M蛋白的許多血清型的B區(qū)都可結(jié)合纖維蛋白原，同樣有助于抗吞噬作用。

4 M蛋白相關(guān)疫苗

由于M蛋白有較好的免疫原性和免疫保護(hù)性，可刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體，成為了疫苗研究的重點。M蛋白的抗原決定簇與人體多種組織抗原存在交叉性，包括心臟、骨骼肌球蛋白、原肌球蛋白、層黏連蛋白和角蛋白等［8］。研究［9］發(fā)現(xiàn)，M蛋白的調(diào)理表位與自身免疫性表位是分隔開的，大多數(shù)組織的交叉性表位被定位在B區(qū)、A-B側(cè)翼區(qū)或B-C側(cè)翼區(qū)，而在A區(qū)和C區(qū)中存在著與人體組織交叉反應(yīng)同時又可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生調(diào)理性抗體的表位。據(jù)此，利用基因重組技術(shù)，M蛋白相關(guān)疫苗的研究有3個策略：①以多種血清型M蛋白N-端可變區(qū)片段為基礎(chǔ)制備多價多肽疫苗；②以M蛋白C-端保守區(qū)保護(hù)性表位為基礎(chǔ)制備多價多肽疫苗；③M蛋白融合其他蛋白的多肽疫苗。

4.1 基于M蛋白N-端的相關(guān)疫苗 M蛋白N-端可變區(qū)具有能夠激發(fā)產(chǎn)生最大殺菌活性抗體的表位，并且?guī)缀鯖]有與人體組織蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)的表位，所以對于該種疫苗的研究備受追捧。Kotloff等［10］成功重組構(gòu)建了含有M24、M1、M3、M5、M6和M19蛋白血清型N-端片段的基因序列，該疫苗的動物實驗顯示，免疫血清中含有相應(yīng)GAS血清型的調(diào)理性抗體，表明該抗體在大多情況下是針對M蛋白保護(hù)性抗原表位所產(chǎn)生的。該種疫苗的Ⅰ期試驗結(jié)果顯示6價M蛋白血清型片段所誘導(dǎo)的抗體滴度顯著增加，同時未檢測到該抗體與人體組織存在交叉反應(yīng)。在此基礎(chǔ)上，由美國ID Biomedical Corporation公司研制出了26價多肽疫苗［11］，采用明礬佐劑免疫家兔，可產(chǎn)生特異性血清IgG抗體，在臨床Ⅰ期試驗中觀察到該疫苗具有良好的免疫原性及顯示出良好的安全性。美國2000－2004年5 400例GAS侵襲性感染病例中，分離出的79%的血清型與該26價疫苗一致［12］，提示該疫苗所包含的表位廣泛分布于該地區(qū)流行的鏈球菌菌株表面，揭示了該疫苗具有應(yīng)用于該地區(qū)臨床的可能性。近日，Dale等［13］基于北美和歐洲時下流行的GAS血清型成功制備出30價疫苗，用此疫苗免疫家兔可得到能調(diào)理該30種血清型的抗血清。然而該疫苗的30種血清型僅能覆蓋馬里和南非GAS感染血清型中的40%和59%。由此可見，該種疫苗制備方法也存在弊端，M蛋白血清型眾多，不可能構(gòu)建一種疫苗可包含所有血清型，這就要求根據(jù)某一地區(qū)、某一時段GAS的流行趨勢選取相應(yīng)血清型設(shè)計疫苗，而該種疫苗只能對當(dāng)?shù)谿AS感染有效，而且一旦流行菌株發(fā)生變化或出現(xiàn)新的菌株則保護(hù)效果大大降低。

4.2 基于M蛋白C-端的相關(guān)疫苗 到目前為止，已經(jīng)有多種方法針對M蛋白C-端保守區(qū)保護(hù)性表位制備相關(guān)GAS疫苗。第1種方法是合成了4個涵蓋M6蛋白C-端重復(fù)區(qū)的重疊肽。使用該多肽滴鼻免疫Swiss CD1小鼠后，再用同源M6和異源M14 GAS分離株分別鼻內(nèi)攻擊小鼠［14］，結(jié)果顯示GAS咽部定植均顯著減少。第2種方法是合成了M5蛋白C-端重復(fù)區(qū)的2種多肽。通過動物實驗的主動免疫和被動免疫發(fā)現(xiàn)［15］，針對M5多肽的血清IgG水平升高，但卻無法在體外誘導(dǎo)調(diào)理吞噬作用。第3種方法是通過識別M5蛋白C-端重復(fù)區(qū)內(nèi)的T、B細(xì)胞表位，構(gòu)建了長度為55個氨基酸的序列（StreptInCor）。對BALB／c小鼠皮下接種，StreptInCor和完全弗氏佐劑／不完全弗氏佐劑共同給予，結(jié)果發(fā)現(xiàn)可以誘導(dǎo)高滴度的血清IgG［16］。第4種方法是從M5蛋白C-端篩選出一段20個氨基酸的多肽（P145），并通過實驗衍生出2個序列，即含有M蛋白保守的B細(xì)胞表位及不與人體發(fā)生交叉反應(yīng)的T細(xì)胞表位，分別命名為J8和J14。研究證明，J8和J14可以誘導(dǎo)小鼠血清特異性Ig G和Ig A［17］水平增高。第5種方法是基于M蛋白C-端重復(fù)區(qū)序列制備活疫苗。首先對CD1小鼠鼻內(nèi)免疫接種表達(dá)M6蛋白C-端重復(fù)序列的牛痘病毒，再進(jìn)行同源M6和異源M14 GAS分離株的鼻內(nèi)攻擊，結(jié)果顯示可顯著減少GAS咽部定植。乳酸乳球菌是一種腸道共生菌群，也被用來作為活疫苗的載體，攜帶M6蛋白C-端重復(fù)區(qū)編碼的基因序列，對CD1小鼠行鼻內(nèi)免疫接種該活疫苗后，導(dǎo)致唾液Ig A和血清IgG水平增高［18］。

4.3 M蛋白融合其他蛋白的多肽疫苗 FbaA（an Fn-binding protein expressed on the surface of GAS）是2001年發(fā)現(xiàn)的GAS表面的一種相關(guān)蛋白，具有較好的免疫原性，可誘發(fā)與M蛋白相當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)性免疫應(yīng)答，且Fba A蛋白在不同的GAS血清型中有很高的同源性。將純化的Fba A蛋白和M蛋白分別皮下免疫小鼠，2組的血清Ig G水平相似且Fba A免疫組的保護(hù)效果僅次于M蛋白免疫組，差異無統(tǒng)計學(xué)意義［19－20］。近期該課題組，利用噬菌體肽庫及單克隆抗體技術(shù)篩選出7個Fba A優(yōu)勢表位，通過PCR技術(shù)將該表位同中國南方地區(qū)流行的4個GAS血清型的M蛋白相融合，構(gòu)建出含有7個Fba A優(yōu)勢表位和5個M蛋白片段的GAS疫苗（F7M5）。其中包括的5個M蛋白片段分別來自M1、M3、M6、M18的N端和C端的共同保守序列J14，將此多肽疫苗免疫小鼠，結(jié)果顯示小鼠血清Ig G水平相較單純應(yīng)用上述5個血清型的多肽疫苗顯著升高。攻毒試驗顯示F7M5蛋白免疫組的保護(hù)率明顯高于其他對照組。表明該種融合疫苗誘導(dǎo)了較高的抗體水平和較好的保護(hù)率［21］。

5 展 望

在過去的幾十年里，對GAS疫苗的研究取得了很大進(jìn)展，研究者除了研究以M蛋白為基礎(chǔ)的疫苗外，還把目光投到其他可能蛋白上，如C5a肽酶［22］、精氨酸脫亞胺酶［23］、鏈球菌分泌酯酶［24］、鏈球菌血紅素蛋白受體［25］等，但目前仍沒有安全有效的商用疫苗問世。總之，GAS疫苗研制中的一些影響因素需要綜合考慮，包括GAS血清型的地理分布差異、該抗原包含自身免疫表位的可能性、人類疫苗佐劑的選擇、設(shè)計合理有效的實驗動物模型等。就我國GAS疫苗研究領(lǐng)域而言，GAS相關(guān)流行病學(xué)資料的不足也是影響疫苗研發(fā)制備的因素。

［1］ Bisno AL，Rubio FA，Cleary PP，et al.Prospects for a group A streptococcal vaccine：rationale，feasibility，and obstacles--report of a National Institute of Allergy and Infectious Diseases Workshop［J］.Clin Infect Dis，2005，41（8）：1150－1156.

［2］ 饒栩栩，黃震東，岑潤超，等.我國風(fēng)濕性心臟病的流行現(xiàn)狀［J］.中華心血管病雜志，1998，26（2）：98－100.

［3］ Pichichero ME，Casey JR.Systematic review of factors contributing to penicillin treatment failure in Streptococcus pyogenes pharyngitis［J］.Otolaryngol Head Neck Surg，2007，137（6）：851－857.

［4］ Baldassarri L，Creti R，Recchia S，et al.Therapeutic failures of antibiotics used to treat macrolide-susceptible Streptococcus pyogenes infections may be due to biofilm formation［J］.J Clin Microbiol，2006，44（8）：2721－2727.

［5］ Courtney HS，Hasty DL，Dale JB.Serum opacity factor（SOF）of Streptococcus pyogenes evokes antibodies that opsonize homologous and heterologous SOF-positive serotypes of group A streptococci［J］.Infect Immun，2003，71（1）：5097－5103.

［6］ Mcarthur J，Medina E，Mueller A，et al.Intranasal vaccination with the streptococcal fibronectin binding protein 1 Sfb1 fails to prevent growth and dissemination of Streptococcus pyogenes in a murine skin infection model［J］.Infect Immun，2004，72（12）：7342－7345.

［7］ Massell BF，Honikman LH，Amezcua J.Rheumatic fever following streptococcal vaccination.Report of three cases［J］.JAMA，1969，207（6）：1115－1119.

［8］ Cunningham MW.Autoimmunity and molecular mimicry in the pathogenesis of post-streptococcal heart disease［J］.Front Biosci，2003，8：533－543.

［9］ Samanidou VF，Nika MK，Papadoyannis IN.HPLC as a tool in medicinal chemistry for the monitoring of tricyclic antidepressants in biofluids［J］.Mini Rev Med Chem，2008，8（3）：256－275.

［10］ Kotloff KL，Corretti M，Palmer K，et al.Safety and immunogenicity of a recombinant multivalent group A streptococcal vaccine in healthy adults.PhaseⅠtrial［J］.JAMA，2004，292（6）：709－715.

［11］ Mcneil SA，Halperin SA，Langley JM，et al.Safety and immunogenicity of 26-valent group a streptococcus vaccine in healthy adult volunteers［J］.Clin Infect Dis，2005，41（8）：1114－1122.

［12］ O′Loughlin RE，Roberson A，Cieslak PR，et al.The epidemiology of invasive group A streptococcal infection and potential vaccine implications：United States，2000－2004［J］.Clin Infect Dis，2007，45（7）：853－862.

［13］ Dale JB，Penfound TA，Chiang EY，et al.New 30-valent M protein-based vaccine evokes cross-opsonic antibodies against non-vaccine serotypes of group A streptococci［J］.Vaccine，2011，29（46）：8175－8178.

［14］ Bessen D，F(xiàn)ischetti VA.Influence of intranasal immunization with synthetic peptides corresponding to conserved epitopes of M protein on mucosal colonization by group A streptococci［J］.Infect Immun，1988，56（10）：2666－2672.

［15］ Bronze MS，Courtney HS，Dale JB.Epitopes of group A streptococcal M protein that evoke cross-protective local immune responses［J］.J Immunol，1992，148（3）：888－893.

［16］ Guilherme L，Postol E，F(xiàn)reschi De Barros S，et al.A vaccine against S.pyogenes：design and experimental immune response［J］.Methods，2009，49（4）：316－321.

［17］ Batzloff MR，Hartas J，Zeng W，et al.Intranasal vaccination with a lipopeptide containing a conformationally constrained conserved minimal peptide，a universal T cell epitope，and a self-adjuvanting lipid protects mice from group A streptococcus challenge and reduces throat colonization［J］.J Infect Dis，2006，194（3）：325－330.

［18］ Mannam P，Jones KF，Geller BL.Mucosal vaccine made from live，recombinant Lactococcus lactis protects mice against pharyngeal infection with Streptococcus pyogenes［J］.Infect Immun，2004，72（6）：3444－3450.

［19］ Ma CQ，Li Ch，Wang XR，et al.Similar Ability of Fba A with M Protein to elicit protective immunity against group a streptococcus challenge in mice［J］.Cell Mol Immunol，2009，6（1）：73－77.

［20］ 李彩虹，馬翠卿，王錦，等.A族鏈球菌表面新發(fā)現(xiàn)蛋白Fba真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答［J］.中國免疫學(xué)雜志，2007，23（9）：835－838.

［21］ Ma C，Liu Z，Li W，et al.Fba A-and M protein-based multiepitope vaccine elicits strong protective immune responses against group A streptococcus in mouse model［J］.Microbes Infect，2014，16（5）：409－418.

［22］ Park HS，Cleary PP.Active and passive intranasal immunizations with streptococcal surface protein C5a peptidase prevent infection of murine nasal mucosa-associated lymphoid tissue，a functional homologue of human tonsils［J］.Infect Immun，2005，73（12）：7878－7886.

［23］ HEnningham A，Chiarot E，Gillen CM，et al.Conserved anchorless surface proteins as group A streptococcal vaccine candidates［J］.Mol Med（Berl），2012，90（10）：1197－1207.

［24］ Liu M，Zhu H，Li J，et al.Group A Streptococcus secreted esterase hydrolyzes platelet-activating factor to impede neutrophil recruitment and facilitate innate immune evasion［J］.PLoS Pathog，2012，8（4）：e1002624.

［25］ Huang YS，F(xiàn)isher M，Nasrawi Z，et al.Defense from the group A streptococcus by active and passive vaccination with the streptococcal hemoprotein receptor［J］.J Infect Dis，2011，203（11）：1595－1601.

（本文編輯：趙麗潔）

R378.12

A

1007-3205（2015）01-0103-05

2014－05－15；

2014－07－11

國家自然科學(xué)基金資助項目（30901350）；河北省自然基金資助項目（H2012206076）

袁婷（1988－），女，河北廊坊人，河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)碩士研究生，從事感染免疫研究。

*通訊作者。E-mail：macuiqing＠sina.com

10.3969／j.issn.1007-3205.2015.01.041