反復(fù)照射建立食管癌放射抗性細(xì)胞系方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性研究

楊延靈，薛曉英，冉玉格，張玉峰，李 鋒，楊 曄

（河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院放療科，河北石家莊050000）

反復(fù)照射建立食管癌放射抗性細(xì)胞系方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性研究

楊延靈，薛曉英*，冉玉格，張玉峰，李 鋒，楊 曄

（河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院放療科，河北石家莊050000）

目的 探討射線反復(fù)照射方法建立食管癌放射抗性細(xì)胞系的重復(fù)性及穩(wěn)定性，并觀察輻射抗性細(xì)胞與其親代細(xì)胞之間的放射敏感性的差異。方法 應(yīng)用射線對人食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞TE13進(jìn)行反復(fù)照射，累計劑量120 Gy，建立具有放射抗性的細(xì)胞系TE13R120。采用細(xì)胞克隆形成實(shí)驗測定2種細(xì)胞的放射生物學(xué)參數(shù)，檢測其輻射抗性，采用單擊多靶模型擬合存活曲線。經(jīng)連續(xù)8 d培養(yǎng)細(xì)胞，繪制2種細(xì)胞的生長曲線并用Logrank檢驗計算群體倍增時間。比較此次實(shí)驗結(jié)果與初次建系時結(jié)果的相似性。結(jié)果 接受120 Gy總劑量照射后，TE13R120較TE13表現(xiàn)出明顯的放射抗性，TE13R120的放射生物學(xué)參數(shù)D0、Dq、N均高于TE13（2.36、2.17、2.50vs1.90、1.11、1.80），SF2、α/β均低于TE13（0.53、2.67vs0.73、8.00）。TE13R120的細(xì)胞群體倍增時間為20.70 h，長于親代TE13（17.67 h）。該結(jié)果與此前初次建系時結(jié)果相似。結(jié)論 應(yīng)用射線反復(fù)照射并逐步篩選建立輻射抗性細(xì)胞系的方法可靠，能建立具有穩(wěn)定輻射抗性表型的細(xì)胞系。

食管腫瘤;輻射耐受性;集落形成單位測定

腫瘤細(xì)胞經(jīng)射線反復(fù)照射可產(chǎn)生放射抗性，而部分細(xì)胞的放射抗性是局控失敗的主要原因，因此應(yīng)用射線反復(fù)照射建立食管放射抗性細(xì)胞系，并進(jìn)行相應(yīng)的分子生物學(xué)研究，對探討食管癌放射抗性形成的分子機(jī)制十分必要。既往的報道多為應(yīng)用已建立的食管癌抗性細(xì)胞系進(jìn)行放射生物學(xué)及分子生物學(xué)研究，但建立放射抗性細(xì)胞系的方法是否可靠、其放射抗性表型是否保持穩(wěn)定目前無人評估確認(rèn)。本研究應(yīng)用相同的親代細(xì)胞、相同的方法重新建立放射抗性細(xì)胞系，并通過克隆形成實(shí)驗和檢測群體倍增時間的方法對其放射抗性表型的穩(wěn)定性進(jìn)行評估，以確認(rèn)放射抗性的穩(wěn)定性，從而評估該方法建立食管癌放射抗性細(xì)胞系的可靠性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 TE13為人食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株，由日本東北大學(xué)細(xì)胞加嶺醫(yī)學(xué)研究所建株，日本岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)部第一外科惠贈。采用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2，飽和濕度的孵箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 照射方法 應(yīng)用高能直線加速器、6MV－X射線照射，照射野10 cm×10 cm，源皮距100 cm，吸收劑量率200 cGy/min，從培養(yǎng)瓶底面給予射線照射，培養(yǎng)瓶下加用1.5 cm組織補(bǔ)償膜。

1.2.2 放射抗拒細(xì)胞系TE13R120的建立 取對數(shù)生長期的TE13細(xì)胞給予200 cGy射線照射，照射后置于孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每24 h換液1次。照射后存活的細(xì)胞再次達(dá)到指數(shù)生長期末時進(jìn)行傳代培養(yǎng)，待新傳代的細(xì)胞穩(wěn)定后給予400 cGy射線照射，重復(fù)以上過程，依次給予600 cGy、800 cGy以及10次1 000 cGy射線照射，累積劑量120 Gy，逐步篩選出具有穩(wěn)定放射抗性表型的細(xì)胞系TE13R120。TE13R120細(xì)胞常規(guī)傳代5代穩(wěn)定后用于以下實(shí)驗。

1.2.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 取對數(shù)生長期的單層細(xì)胞，倒置相差顯微鏡下觀察2種細(xì)胞的形態(tài)學(xué)差異。

1.2.4 克隆形成實(shí)驗測定放射敏感性 設(shè)定0、2、4、6和8Gy 5個劑量點(diǎn)，0.25%胰蛋白酶和0.02%乙二胺四乙酸 （ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）消化細(xì)胞并計數(shù)，分別接種1×105指數(shù)生長期的TE13和TE13R120細(xì)胞到25 cm2培養(yǎng)瓶中，24 h后給予X射線照射。照射后消化細(xì)胞并計數(shù)，將細(xì)胞懸液作梯度倍數(shù)稀釋，按不同劑量點(diǎn)接種適量細(xì)胞到60 mm培養(yǎng)皿中，每個劑量點(diǎn)設(shè)3個平行樣，5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)直至培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克?。?0～14 d）終止培養(yǎng)。棄去舊培養(yǎng)基，PBS小心洗2次，甲醇固定15 min，0.5%結(jié)晶紫染液染色30 min，流水緩慢沖去結(jié)晶紫染液，自然晾干。肉眼直接計數(shù)克隆數(shù)或在顯微鏡下計數(shù)克隆數(shù)，≥50個細(xì)胞的集落作為一個克隆。按照以下公式計算不同劑量的存活分?jǐn)?shù)。

存活分?jǐn)?shù)（SF）=實(shí)驗組集落形成率/對照組集落形成率

集落形成率（PE）=對照組形成集落數(shù)/對照組種植細(xì)胞數(shù)

應(yīng)用SPSS13.0軟件，采用單擊多靶模型S= 1－（1－e－D/D0）N擬合細(xì)胞存活曲線并計算放射生物學(xué)參數(shù)D0、Dq、N和SF2（照射2Gy后細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)）;LQ模型（線性二次模型）SF=e－（αD+βD2）計算α、β、α/β值。

1.2.5 繪制TE13細(xì)胞和TE13R120細(xì)胞的生長曲線 消化對數(shù)生長期的2種細(xì)胞并計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為1×104/mL，接種到24孔板，分為8組，每組3個復(fù)孔，每孔接種1×104細(xì)胞。24 h后消化第一組細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，以后每隔24 h消化一組細(xì)胞。計算每天3個孔的細(xì)胞數(shù)的平均值，然后以天數(shù)為橫坐標(biāo)，以細(xì)胞數(shù)的對數(shù)為縱坐標(biāo)做半對數(shù)曲線。根據(jù)公式TD=T×log2/（logNt－LogN0），計算TE13和TE13R120細(xì)胞的群體倍增時間TD。其中T為Nt－N0的時間，N0為對數(shù)生長期理論初始值，Nt為對數(shù)生長期任一點(diǎn)的理論觀察值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，所有實(shí)驗至少重復(fù)3次，結(jié)果以±s表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗。P＜0.05為有差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué) 相差顯微鏡下可見正常生長的2種細(xì)胞呈單層、多邊形貼壁生長。TE13細(xì)胞之間界限不夠清楚，呈片狀生長;TE13R120細(xì)胞輪廓較清晰，細(xì)胞細(xì)長，大小不一，排列紊亂無規(guī)律，形態(tài)不規(guī)則，呈梭形或紡錘體形（圖1）。

2.2 TE13及TE13R120放射抗性 各種形式的克隆照片（圖2）。采用單擊多靶模型擬合細(xì)胞存活曲線（圖3），根據(jù)單機(jī)多靶模型及LQ模型計算出放射生物學(xué)參數(shù) D0、Dq、N、α、β、α/β及SF2值（表1），TE13R120細(xì)胞的D0、Dq和 N值與親代細(xì)胞TE13相比均增大，α/β比值降低，提示TE13R120較其親本細(xì)胞更具放射抗性;2 Gy時存活分?jǐn)?shù)SF2是代表細(xì)胞放射敏感性的重要指標(biāo)，SF2越大，放射抗拒性越強(qiáng)，TE13R120細(xì)胞的SF2值高于親代細(xì)胞TE13，進(jìn)一步說明TE13R120細(xì)胞的放射抗性增強(qiáng)。

2.3 細(xì)胞生長曲線的繪制 連續(xù)8 d計數(shù)24孔板中的細(xì)胞數(shù)，繪制出TE13細(xì)胞和TE13R120細(xì)胞的半對數(shù)生長曲線（圖4）。從圖中可以看出TE13R120細(xì)胞的生長速率較TE13慢。TE13R120細(xì)胞的群體倍增時間為（20.70±0.57）h，長于親代細(xì)胞TE13（17.67±0.99）h（t=2.646，P=0.024）。

表1 TE13和TE13R120放射生物學(xué)參數(shù)Table 1 Radiobiological parameters of TE13 and TE13R120

3 討 論

食管癌是世界上最常見的六大惡性腫瘤之一，手術(shù)是食管癌根治性治療手段，放療是中晚期食管癌的重要治療手段。近年來隨著精確放療技術(shù)在臨床上的應(yīng)用，基本解決了放射物理學(xué)因素對食管癌放療效果的影響，局控率和生存率有所提高，食管癌放療的5年生存率能達(dá)到26.3%［1］或更高，但5年生存率較以往提高仍不明顯，局部未控和復(fù)發(fā)仍然是治療失敗的主要原因，因此放射生物學(xué)因素，即部分腫瘤細(xì)胞對放射線的抵抗可能是局部未控和復(fù)發(fā)的主要原因。

腫瘤細(xì)胞在輻射作用下可發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition，EMT），Zhang等［2］證實(shí)低劑量輻射可誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞MCF－7形態(tài)發(fā)生紡錘樣改變;Kawamoto等［3］也證實(shí)，輻射可使結(jié)直腸癌細(xì)胞CaR1、DLD1失去極性，出現(xiàn)偽足，形成紡錘體樣改變，最終發(fā)生EMT。謝聰穎等［4］的研究觀察到放射抗拒性細(xì)胞株KYSE－150R在形態(tài)上較母株KYSE－150更加不規(guī)則，細(xì)胞呈紡錘體狀，極性消失，且KYSE－150R細(xì)胞株中波形蛋白表達(dá)顯著增加（P=0.03）。該實(shí)驗提示放療過程產(chǎn)生的EMT與反射抗拒的發(fā)生有關(guān)。另有研究表明發(fā)生EMT變化的細(xì)胞對放射線比較抗拒［5］。顯微鏡下觀察本研究中得出的放射抗性細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞細(xì)長，大小不一，排列紊亂無規(guī)律，形態(tài)不規(guī)則，呈梭形或紡錘體形，形態(tài)上符合EMT改變?？寺⌒纬蓪?shí)驗顯示TE13R120細(xì)胞的D0值和SF2明顯高于放療前的腫瘤細(xì)胞，說明腫瘤細(xì)胞經(jīng)放射線照射后產(chǎn)生了輻射抗拒。通過射線反復(fù)照射腫瘤細(xì)胞建立具有放射抗性表型的細(xì)胞系，并應(yīng)用各種分子生物學(xué)實(shí)驗手段比較其與親代細(xì)胞之間的各種分子差異是揭示腫瘤細(xì)胞放射抗性形成機(jī)制的有效途徑［6］。張萍等［7］反復(fù)多次照射食管癌細(xì)胞TE13，累計劑量120 Gy，建立了放射抗性細(xì)胞系 TE13R120，TE13和TE13R120的D0值分別為1.63和2.85 Gy，SF2分別為0.55和0.64。Mitsuhashi等［8］反復(fù)照射鼠卵巢癌細(xì)胞系NMT21，建立了具有輻射抗拒性的NMT21R細(xì)胞系，D0值1.65 Gy，高于其親代細(xì)胞 NMT21 （0.97 Gy）;SF2值0.42，明顯高于NMT21（0.28）。謝聰穎等［4］的研究中發(fā)現(xiàn)人食管鱗癌放射抗拒細(xì)胞株KYSE－150R的SF2、D0、Dq及N值均高于母株KYSE－150。有研究表明環(huán)氧化酶2（cyclooxygenase－2，COX－2）的表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞放射敏感性呈負(fù)相關(guān)［9］。侯磊等［10］的研究發(fā)現(xiàn)輻射累計劑量在40 Gy時的Eca－109細(xì)胞COX－2的表達(dá)較親代細(xì)胞Eca－109高（P＜0.05），癌細(xì)胞放射敏感性降低（P＜0.05）。但這種反復(fù)照射建立的放射抗性細(xì)胞系其放射抗性表型是否能穩(wěn)定存在，或者這種建立放射抗性細(xì)胞系的方法是否可重復(fù)或可靠，從未有人進(jìn)行實(shí)驗和評估。本研究再次將TE13細(xì)胞進(jìn)行重復(fù)多次照射，逐步篩選建立放射抗性細(xì)胞系TE13R120。通過克隆形成實(shí)驗檢測其與親代細(xì)胞的之間的放射敏感性差異，并測定2種細(xì)胞的群體倍增時間，將實(shí)驗結(jié)果與張萍等得出的結(jié)果進(jìn)行比較，從而評價該方法建立放射抗性細(xì)胞系的可靠性以及抗性細(xì)胞所獲得的放射抗性是否穩(wěn)定存在。結(jié)果顯示，本研究建立的食管癌放射抗性細(xì)胞株TE13R120的D0值和SF2值明顯高于其親代細(xì)胞TE13，與張萍等［7］的研究結(jié)果一致，說明應(yīng)用電離輻射反復(fù)照射并逐步篩選建立輻射抗性細(xì)胞系的方法可靠，能建立穩(wěn)定的具有輻射抗性表型的細(xì)胞系。有研究提出組織的輻射敏感性與組織內(nèi)細(xì)胞的分裂頻率成正比，也就是說輻射抗拒的組織其細(xì)胞分裂較慢，而輻射敏感的組織其細(xì)胞分裂相對較快。本研究根據(jù)連續(xù)8 d測得的數(shù)據(jù)繪制了 TE13及TE13R120細(xì)胞的生存曲線，可以看出TE13R120生長速度明顯慢于TE13細(xì)胞，計算得出的2種細(xì)胞的群體倍增時間分別為20.70 h和17.67 h（P= 0.024），TE13R120較TE13的群體倍增時間明顯延長。這一結(jié)論從側(cè)面驗證了TE13R120細(xì)胞獲得了輻射抗拒性。

放射抗性細(xì)胞系TE13R120從放射生物學(xué)和細(xì)胞倍增時間上均具有穩(wěn)定性，是具有穩(wěn)定輻射抗性表型的細(xì)胞系。這種方法建立的放射抗性細(xì)胞系與其親代細(xì)胞有著相同背景，卻具有不同的放射敏感性，是研究腫瘤細(xì)胞放射抗性形成機(jī)制的理想實(shí)驗對比模型。

目前認(rèn)為，同一細(xì)胞群可能同時存在對放射線敏感和抗拒的亞群，接受放射線照射后敏感的細(xì)胞被射線殺死，抗拒細(xì)胞在射線作用下繼續(xù)增殖，多次大劑量照射后放射敏感的細(xì)胞死亡，抗拒細(xì)胞不斷增多，使整個細(xì)胞群體輻射抗性增加;也可能是由于放射線引起分子水平上的一些變化，這些變化在細(xì)胞增殖過程中穩(wěn)定的傳給后代成為突變，使后代細(xì)胞獲得放射抗拒表型。

總之，腫瘤細(xì)胞輻射抗性形成的確切機(jī)制還不確定，但無論怎樣，利用放射線反復(fù)照射逐步篩選建立放射抗性細(xì)胞系的過程基本模擬患者的放射治療過程，其輻射抗性產(chǎn)生的過程也應(yīng)與實(shí)際治療過程中輻射抗性產(chǎn)生的途徑有相似性，而且本實(shí)驗顯示，該方法建立的細(xì)胞系所獲得的放射抗性穩(wěn)定、可重復(fù)，是可靠的。（本文圖見封三）

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（本文編輯：許卓文）

Repeatability and stability of repeated irradiation method to establish the radioresistant esophageal cancer cell line

YANG Yan－ling，XUE Xiao－ying*，RAN Yu－ge，ZHANG Yu－feng，LIFeng，YANG Ye
Department of Radiotherapy，the Second Hospital of Heibei Medical University，Shijiazhuang，050000，China）

Objective To study the repeatability and stability of repeated irradiation method to establish the radioresistant esophageal cancer cell line and to observe the variation of radiosensitivity between the radioresistant cell line and its parental cell line.MethodsA radioresistant cell line，TE13R120，was established from a human esophageal squamous cancer cell line TE13 by repeated irradiation，120 Gy in total dose.Colony formation assay was used to calculate the radiation biology parameters and detect radiation resistance.Besides，multi－target single－h(huán)itmodel was adopted to fit dosesurvival curve of TE13 and TE13R120 cell.The cells were cultrured for 8 d，the cell growth curve was drawn to calculate the population doubling time of TE13 and TE13R120 cell.ResultsAfter radiation by 120 Gy in total dose，TE13R120 cell line showed significant radioresistance compared with its parental cells TE13.The D0，Dq，and N of TE13R120 showed siguificant radioresitance as compared with those of TE13（2.36，2.17，2.50vs1.90，1.11，1.80），but SF2，a/βwere lover in the former cell line（0.53，2.67vs0.73，8.00）.The population doubling time of TE13R120 was 20.70 h，longer than its parental cell line TE13（17.67 h）.The resultswere similarwith those of the first establish line.ConclusionTheradioresistant cell line established by repeated radiation exposures and gradually screening is reliable since it can build a stable cell line with radioresistant phenotype.

esophageal neoplasms;radiatoon tolerance;colony forming units assay

R735.1

A

1007－3205（2015）02－0300－04

2014－10－15;

2014－11－20

河北省自然科學(xué)基金項目（C2009001151）

楊延靈（1986－），女，河南開封人，河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事食管癌放射治療的臨床與基礎(chǔ)研究。

*通訊作者。E－mail：xxy6412@163.com

10.3969/j.issn.1007－3205.2015.03.015