苦參提取液對腸致病性大腸桿菌感染小鼠的療效研究

吳蕊，余新超

（安徽理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，安徽淮南232001）

苦參提取液對腸致病性大腸桿菌感染小鼠的療效研究

吳蕊，余新超

（安徽理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，安徽淮南232001）

目的研究苦參提取液對腸致病性大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株O10（EPECO10）感染小鼠腸道的保護作用。方法將50只小鼠平均分為五組，每組10只，分別為模型組、治療組Ⅰ（高濃度，含生藥濃度為0.500 g/mL）、治療組Ⅱ（中濃度，含生藥濃度為0.250 g/mL）、治療組Ⅲ（低濃度，含生藥濃度為0.125 g/mL）及空白組?？瞻捉M小鼠腹腔注射生理鹽水，其余四組小鼠腹腔注射EPECO10菌液建立腹瀉模型，治療組Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ給予不同濃度的苦參灌胃，模型組和空白組用生理鹽水灌胃。比較五組小鼠腹瀉指數(shù)、炎癥評分及腸道中超氧化物歧化酶（SOD）的含量。結(jié)果模型組小鼠的腹瀉指數(shù)、炎癥評分及腸道SOD的表達(dá)與治療組Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論苦參提取液可以明顯減輕小鼠的腹瀉癥狀，改善其腸道的病理表現(xiàn)，具有良好的治療效果。

腸致病性大腸桿菌；腹瀉；動物實驗；超氧化物歧化酶；苦參

腸致病性大腸桿菌（EPEC）是造成小兒腹瀉常見的條件致病菌，感染后的兒童（尤其是2歲以下的嬰幼兒）可以出現(xiàn)持續(xù)性腹瀉、腹痛，嚴(yán)重者可出現(xiàn)脫水而導(dǎo)致死亡。目前，臨床上治療由該菌引起的腹瀉主要采用抗生素，其初期使用效果尚好，長期使用存在多種不良反應(yīng)。為進(jìn)一步探究中藥對該病的治療效果，本研究采用前期體外實驗篩選出的對EPEC抑制作用較好的苦參，通過腹腔注射建立小鼠腹瀉模型，觀察該藥在小鼠體內(nèi)對EPEC的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料清潔級BALB／C小鼠50只（購自安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心），雌雄各半。致病性大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株O10（EPECO10，購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院），苦參（購自淮南恒康大藥房），超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（購自南京建成生物工程研究所）。

1.2 方法

1.2.1 實驗菌液的制備將EPECO10經(jīng)復(fù)壯培養(yǎng)后，增菌培養(yǎng)2～3代，挑選單個菌落接種于LB（溶菌肉湯）培養(yǎng)基中，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h。采用平皿表面活菌計數(shù)法確定菌液濃度為5×109cfu/mL。

1.2.2 苦參液的制備稱取苦參50 g，清洗、烘干、過篩、粉碎（程度以20目篩為宜），加水500 mL，將中藥浸泡在水中，加熱至沸騰后，改用文火再加熱30 min，趁熱將濾液濾出，再將濾渣加8倍水，二次煎煮30 min后將2次煎煮所得濾液合并在一起，水浴濃縮后，用100 mL容量瓶定容，裝瓶后壓橡膠和鋁蓋，流動蒸汽滅菌（壓力為103.4 kPa）20 min后取出，復(fù)溫至室溫（22℃）條件下，置于4℃冰箱內(nèi)冷藏備用。所得苦參水煎劑含生藥濃度為0.500 g/mL。

1.2.3 動物分組及處理參照文獻(xiàn)[1]方法，將50只小鼠均分為五組，每組10只，分別為模型組、治療組Ⅰ（高濃度，含生藥濃度為0.500 g/mL）、治療組Ⅱ（中濃度，含生藥濃度為0.250 g/mL）、治療組Ⅲ（低濃度，含生藥濃度為0.125 g/mL）及空白組。模型組，治療組Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ每只小鼠按體質(zhì)量每10克腹腔注射制備好的0.2 mL EPECO10菌液建立腹瀉模型[2]，空白組每只小鼠腹腔注射等體積生理鹽水。模型組在注射EPECO10菌液4 h后用0.3 mL生理鹽水灌胃，治療組Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ在注射EPECO10菌液4 h后分別用0.3 mL高、中、低濃度苦參液灌胃，空白組在注射生理鹽水4 h后用0.3 mL生理鹽水灌胃。以上五組均為每12小時灌胃1次，連續(xù)給藥3 d。

1.2.4 檢測指標(biāo)

1.2.4.1 臨床指標(biāo)參考文獻(xiàn)[3]關(guān)于腹瀉的評價指標(biāo)，腹腔注射EPECO10菌液4 h后觀察小鼠的精神狀況、行為動作及大便情況；觀察各組小鼠6 h內(nèi)不同時間段稀便次數(shù)、總便次數(shù)、稀便級，計算稀便率和腹瀉指數(shù)。（1）稀便率：每只動物所排稀便次數(shù)與總便次數(shù)之比。（2）稀便級：表示稀便的程度，以稀便污染濾紙形成污跡面積的大小分為4級。直徑小于1 cm為1級，1～＜2 cm為2級，2～＜3 cm為3級，≥3 cm為4級。污跡為較規(guī)則圓形者測其直徑，不規(guī)則形狀則測量其最長和近似圓的直徑，兩數(shù)相加除以2。統(tǒng)計時先逐個測量每一堆稀便的級數(shù)，然后將該鼠所有稀便級數(shù)相加，除以稀便次數(shù)得每只小鼠稀便的平均級數(shù)，平均稀便級=稀便級數(shù)之和/稀便次數(shù)。腹瀉指數(shù)=稀便率×平均稀便級。

1.2.4.2 病理指標(biāo)實驗結(jié)束前1 d禁食不禁飲。實驗當(dāng)天采用頸椎脫臼法處死全部小鼠，剖腹取幽門至回盲部小腸2 cm，10%中性甲醛中固定，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，行蘇木素-伊紅染色（HE染色），光鏡下觀察。判定炎癥程度并評分[3]。正常（0分）：固有層無中性粒細(xì)胞浸潤，間質(zhì)無水腫。輕度（1分）：固有層少量中性粒細(xì)胞浸潤，不浸潤黏膜，間質(zhì)輕度水腫；中度（2分）：固有層中等量中性粒細(xì)胞浸潤，少量黏膜中有中性粒細(xì)胞浸潤，間質(zhì)中度水腫；重度（3分）：固有層大量中性粒細(xì)胞浸潤，延及整個黏膜層，間質(zhì)重度水腫甚至壞死。

1.2.4.3 小腸中SOD測定處死小鼠后剖腹取小鼠回盲部以上回腸組織8 cm，經(jīng)冰鹽水漂洗、濾紙吸干后制成10%組織勻漿，取上清液采用硝酸鹽法測定腸道中SOD值，操作方法嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以±s表示，采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組臨床指標(biāo)比較除空白組外，其余各組小鼠注射EPECO10菌液4 h后先后出現(xiàn)不同程度的腹瀉，表現(xiàn)為倦怠、精神萎靡，肛周黏附黃色黏液便甚至稀便，內(nèi)容物減少，食欲減退，部分小鼠出現(xiàn)毛發(fā)稀疏、凌亂。表明腹瀉小鼠模型成功建立。與模型組比較，治療組Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ小鼠的腹瀉癥狀均有所好轉(zhuǎn)，稀便率降低，腹瀉指數(shù)降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表1。

2.2 各組病理指標(biāo)比較空白組小鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)清晰，黏膜完整。模型組小鼠結(jié)腸組織黏膜水腫、充血，腸絨毛排列欠整齊，上皮細(xì)胞脫落。經(jīng)苦參灌胃后小鼠腸道組織黏膜水腫明顯好轉(zhuǎn)，其中治療組Ⅰ、Ⅱ小鼠黏膜完整、腸絨毛排列整齊，未見明顯上皮細(xì)胞脫落。治療組Ⅲ小鼠腸道黏膜輕度水腫，但未見明顯上皮細(xì)胞脫落。模型組小鼠腸道炎癥評分明顯高于空白組。治療組Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ小鼠腸道炎癥評分明顯高于模型組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表2。

表1 各組臨床指標(biāo)比較（±s）

表1 各組臨床指標(biāo)比較（±s）

注：與模型組比較，aP＜0.01。

組別模型組治療組Ⅰ治療組Ⅱ治療組Ⅲ空白組n 稀便率（%）腹瀉指數(shù)10 10 10 10 10 95.00±3.17 12.00±2.80 23.00±4.12 37.00±3.55 0.00±0.00 2.81±0.59 0.25±0.17a0.46±0.22a0.78±0.21a0.00±0.00

表2 各組病理指標(biāo)比較（±s，分）

表2 各組病理指標(biāo)比較（±s，分）

注：與模型組比較，aP＜0.01。

組別模型組治療組Ⅰ治療組Ⅱ治療組Ⅲ空白組n 炎癥評分10 10 10 10 10 2.83±0.33 0.65±0.58a1.30±0.48a1.50±0.53a0.00±0.00

2.3 各組小腸SOD水平比較治療組Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ小腸SOD水平與模型組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。治療組Ⅰ、Ⅱ小腸SOD水平與空白組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。治療組Ⅲ小腸SOD水平與空白組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表3。

表3 各組小腸SOD水平比較（±s）

表3 各組小腸SOD水平比較（±s）

注：與模型組比較，aP＜0.01；與空白組比較，bP＜0.01。

組別模型組治療組Ⅰ治療組Ⅱ治療組Ⅲ空白組n SOD含量（nmol/mg pro）10 10 10 10 10 37.30±2.21 103.30±4.02a101.40±11.30a68.80±3.96ab118.59±8.99

3 討論

EPEC相關(guān)性腹瀉是一種常見的人畜共患性疾病，然而對于其致瀉的致病機制、致病過程，迄今為止仍不是很清楚。目前，臨床治療由EPEC引起的相關(guān)疾病主要是以抗生素為主，但抗生素價格昂貴、不良反應(yīng)大，隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，EPEC對多種抗生素表現(xiàn)出很強的耐藥性，而且其耐藥率有逐年升高的趨勢。因此，不少學(xué)者試圖從其他方面尋找有效的解決途徑。苦參的有效成分為苦參堿，可以清熱燥濕，能有效對抗炎性反應(yīng)[4-5]，是常用的中藥材之一。作者通過前期體外實驗觀察發(fā)現(xiàn)，苦參對EPEC有明顯的抑制作用。本研究通過腹腔注射EPECO10菌液成功建立了小鼠腹瀉模型，并發(fā)現(xiàn)苦參對腹瀉小鼠的腸道保護作用，與相關(guān)研究報道一致[6-7]。通過比較不同濃度苦參液對小鼠腹瀉指數(shù)及腸道炎癥的影響，發(fā)現(xiàn)治療組Ⅰ、Ⅱ療效優(yōu)于治療組Ⅲ，但各組之間未發(fā)現(xiàn)明顯差異，說明在低濃度時苦參液仍可以對小鼠的腹瀉起到一定的保護作用。

SOD是一種超氧化物歧化酶，當(dāng)組織中出現(xiàn)炎癥時會產(chǎn)生大量的O2-，SOD可清除體內(nèi)過多的O2-，保護細(xì)胞免受損傷，是常見的自由基清除酶，其活性高低可間接反映體內(nèi)清除自由基的能力[8]。腸道發(fā)生炎癥時，各種有害因子，如一氧化氮（NO）、丙二醛（MDA）等大量產(chǎn)生，消耗大量SOD，使得保護性因子SOD持續(xù)下降，隨著炎癥好轉(zhuǎn)，SOD可明顯升高[9]。本研究結(jié)果顯示，在小鼠腸道炎癥模型中，與模型組比較，治療組Ⅰ、Ⅱ小腸SOD水平有明顯增高，與相關(guān)研究報道一致[10-11]。治療組Ⅲ小腸SOD水平增高不明顯，分析其原因可能是藥物濃度偏低，對腸道的保護作用不如高、中濃度，可見苦參對小鼠腸道的保護作用與其濃度呈正相關(guān)。

綜上所述，苦參不僅具有明顯的體外抑菌效果，而且在改善由EPEC引起的小鼠腹瀉癥狀、保護腸道組織方面也存在一定的治療價值。由于本實驗條件有限，所使用EPEC為標(biāo)準(zhǔn)菌株，并未復(fù)制出臨床菌株致瀉的動物模型，因此，動物實驗并不能說明臨床問題，需要在今后的實驗中進(jìn)一步明確。

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Curative effect of sophora flavescens extraction in treatment of enteropathogenic E.coli of infected mice

Wu Rui，Yu Xinchao
（Anhui University of Science and Technology，Huainan，Anhui 232001，China）

ObjectiveTo approach the protection action of sophora flavescens extraction extraction on enteropathogenic E.coli standard strain O10（EPECO10）infecting mice intestinal tract.MethodsThe 50 mice were divided into five groups，10 of each group，including the model group，the treatment groupⅠ（high concentration including drug concentration 0.500 g/mL），the treatment groupⅡ（median concentration including drug concentration 0.250 g/mL），the treatment groupⅢ（low concentration including drug concentration 0.125 g/mL）and the blank group.The blank group was intraperitoneally injected normal saline.The diarrhea mice in the rest four groups were established model by intraperitoneal injection of EPECO10 bacteria liquid.The treatment groupⅠ，Ⅱ，Ⅲwere given by gavage with different concentrations of sophora flavescens extraction while the model group and the blank group with NS.The diarrhea parameters，intestinal inflammation scoring and the activities of superoxide dismutase（SOD）content.ResultsCompared the diarrhea parameters，intestinal inflammation scoring and the activities of superoxide dismutase（SOD）expression in the model group and the treatment groupⅠ，Ⅱ，Ⅲ，whose difference had statistical significance（P＜0.01）.ConclusionsSophora flavescens extraction may significantly reduce the diarrhea symptom of the mice，improving the pathological changes of the intestinal tract and having a good treatment effect.

Enteropathogenic escherichia coli；Diarrhea；Animal experimentation；Superoxide dismutase；Sophora flavescens

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.05.010

:A

:1009-5519（2015）05-0665-03

2014-09-24）

安徽省高等學(xué)校省級優(yōu)秀青年人才基金項目（2011SQRL046）。

吳蕊（1980-），女，安徽淮南人，碩士研究生，講師，主要從事護理教學(xué)工作；E-mail：lemonwurui@163.com。通訊作者：余新超（（E-mail：yuxinchao1965@126.com）。