硫酸鋅預處理對成年大鼠缺氧/復氧心肌細胞超微結構的影響

侯偉波，張永國，王穎，王海英，喻田

（遵義醫(yī)學院麻醉學系，貴州遵義563003）

硫酸鋅預處理對成年大鼠缺氧/復氧心肌細胞超微結構的影響

侯偉波，張永國，王穎，王海英，喻田

（遵義醫(yī)學院麻醉學系，貴州遵義563003）

目的研究硫酸鋅預處理對成年大鼠缺氧/復氧心肌細胞超微結構的影響。方法分離培養(yǎng)SD成年大鼠心肌細胞，建立心肌細胞缺氧/復氧損傷模型，將細胞隨機分為正常組（N組）、缺氧/復氧組（H/R組）、缺氧預處理組（HP組）、硫酸鋅（ZnSO4）預處理組（ZnP組），分別進行相應處理，然后用透射電鏡對各組心肌細胞超微結構進行觀察，并進行線粒體評分。結果N組、HP組、ZnP組超微結構優(yōu)于H/R組，且線粒體評分較H/R組低，差異均有統計學意義（P＜0.05）；HP組、ZnP組超微結構變化相似，且兩組線粒體評分比較，差異無統計學意義（P＞0.05），但均高于N組，差異有統計學意義（P＜0.05）。結論缺氧/復氧可造成成年大鼠心肌細胞超微結構的損傷，ZnSO4預處理、缺氧預處理均能減輕該損傷，且二者效果相當。

肌細胞，心臟；硫酸鋅；大鼠；線粒體；超微結構；缺氧/復氧損傷

心肌缺血再灌注損傷（MIRI）是目前影響心臟手術成功率和患者術后恢復的重要因素之一，因此，國內外學者對其研究也出現了多元化、多層次性，使預防MIRI的措施層出不窮。隨著相關研究的深入，微量元素鋅在減輕MIRI中的重要作用逐漸被人們所重視。Xu等[1]研究發(fā)現，在大鼠心臟上，鋅可通過增強再灌注損傷補救激酶（RISK）通路活性在后處理保護心肌作用時扮演重要角色，但其通過預處理產生心肌保護的作用卻少見報道。因此，本研究擬通過建立大鼠心肌細胞缺氧/復氧損傷模型，選擇硫酸鋅（ZnSO4）直接作用于心肌細胞，觀察微量元素鋅預處理對缺氧/復氧心肌細胞超微結構的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物無特定病原體（SPF）級健康雄性SD大鼠6只，體質量250～300 g，16～20周齡，由第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院醫(yī)學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（渝2012-0005）。

1.1.2 主要試劑Hcylon M199培養(yǎng)基、索來寶N-2-羥-酸哌嗪-N-2-乙磺酸（HEPES）、層黏連蛋白、肌酸、?；撬?、牛血清清蛋白（BSA）、乙二醇雙（2-氨基乙醚）四乙酸（EGTA）、Ⅱ型膠原酶等試劑均購自美國Sigma公司，其他均為國產分析純。

1.1.3 主要儀器langendorff離體灌注系統，Thermo CO2培養(yǎng)箱，Thermo CO2缺氧培養(yǎng)箱，H7500透射電子顯微鏡（日立公司），CyberScan310型pH計（美國優(yōu)特EUTECH），去離子水處理器（美國Mili QA），BS224S電子天平（德國Sartorius），5804R型Eppendorf臺式高速離心機（德國Eppendorf）。

1.2 方法

1.2.1 心肌細胞分離培養(yǎng)心肌細胞的分離培養(yǎng)參照文獻[2]進行，具體步驟如下：（1）SD大鼠腹腔注射肝素（250 U/kg）、戊巴比妥鈉（40 mg/kg），待大鼠麻醉后將其固定于宰鼠板上，75%乙醇消毒皮膚，沿劍突下肋緣迅速剪開腹壁，剪開膈肌，沿兩側腋前線剪開胸壁翻向頭側，于心臟根部保留主動脈3～4 mm處剪下心臟，立即放入提前加熱至37℃750 μmol/L Ca2+液中輕輕擠壓心臟2～3次，使心腔殘留的血液排盡。（2）迅速用鑷子于液面下夾起大鼠心臟主動脈根部固定于langendorff離體灌注系統的灌注針上（流量設置為9 mL/g心臟組織）；依次灌注經氧和的37℃、750 μmol/L Ca2+液2 min，100 μmol/L EGTA 4 min，心肌細胞酶消化液7～8 min。（3）灌注完成后于主動脈根部剪下心臟，從主動脈向心尖剪開心肌，放入無菌燒杯中，加入含有1%BSA的心肌細胞酶消化液5 mL，于37℃恒溫水浴搖床在氧合情況下手動振蕩，每次5 min，200目金屬濾網過濾收集在無菌離心管里，置于37℃恒溫水浴箱內自然下沉，重復4～5次，收集細胞沉淀，酶洗脫洗滌細胞沉淀3次，最后用改良型M199培養(yǎng)基洗滌3次。（4）用0.4%臺盼藍1∶1染色，倒置相差顯微鏡下觀察心肌細胞形態(tài)，評價存活率（80%以上），計數細胞，將細胞以每毫升106個的密度均勻鋪于6孔板，每孔2 mL。培養(yǎng)3 h后更換培養(yǎng)基，去除未貼壁細胞。繼續(xù)培養(yǎng)過夜，然后進行隨機分組處理。

1.2.2 實驗分組及處理將培養(yǎng)的心肌細胞隨機分為四組。（1）正常組（N組）：于37℃中95%空氣和5%CO2正常培養(yǎng)箱中持續(xù)培養(yǎng)105 min；（2）缺氧/復氧組（H/R組）：將正常培養(yǎng)的心肌細胞置于95%N2和5%O2缺氧培養(yǎng)箱中缺氧45 min后重新置于正常培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60min；（3）缺氧預處理組（HP組）：首先將細胞進行3次短時間缺氧（每次2 min），然后在每次短時間缺氧后分別復氧2、3、5 min，缺氧復氧處理同H/R組；（4）ZnSO4預處理組（ZnP組）：先給正常培養(yǎng)的細胞中加入終濃度為10μmol/L的ZnSO4水溶液，正常培養(yǎng)30min，其余處理同H/R組。

1.2.3 取材及透射電鏡觀察各組細胞在培養(yǎng)結束之后立即用細胞刮輕輕將細胞刮下，收集于1.5 mL EP管中，1 200 r/min、4℃離心10 min，棄上層培養(yǎng)基，沿管壁緩慢加入4℃預冷的4%戊二醛溶液，對標本進行預固定，然后送至重慶醫(yī)科大學電鏡室進行后續(xù)的后固定、脫水、包埋、聚合、切片、染色、觀察。每個標本觀察6～10個視野，對每個標本的超微結構變化進行比較，并且每個標本選取100個線粒體進行評分。線粒體評分標準參照Flameng分級分為0～4級，分別為0～4分。見表1。

表1 線粒體Flameng評分標準

1.3 統計學處理應用SPSS17.0統計軟件進行數據分析，計數資料以±s表示，組間采用單因素方差（ANOVA）分析，方差齊選用LSD法，方差不齊選用Dunnett T3法行組間兩兩多重比較，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠心肌細胞超微結構觀察電鏡下心肌細胞的損傷主要歸納為以下4點：（1）膜系統損傷（線粒體、肌漿網腫脹、肌膜破裂）；（2）收縮成分破壞；（3）細胞內水腫；（4）糖原顆粒減少。

2.1.1 N組心肌細胞超微結構描述N組細胞質中有豐富的線粒體，呈圓形或橢圓形，且排列整齊。線粒體嵴密集，充滿整個線粒體腔，嵴上附著大量基質顆粒；細胞核位于細胞中央，呈長桿狀，核膜完整，兩層核膜清晰可辨；細胞縱切面可見細胞質充滿縱行排列的肌原纖維：I帶、A帶、H帶與M線均清晰可辨，形成明暗相間的肌節(jié)結構；核周與肌絲間有少量糖原顆粒；其他細胞器改變均不明顯。見圖1A。

2.1.2 H/R組心肌細胞超微結構變化H/R組心肌細胞線粒體排列紊亂，基膜基板不清楚，線粒體普遍腫脹、外膜不完整，嵴減少、不規(guī)則或斷裂成絮狀，部分線粒體損傷嚴重、破裂、溶解，甚至空泡或囊泡化；細胞核形狀不規(guī)則，核內染色質凝集，核膜溶解消失；心肌肌原纖維排列紊亂，大面積斷裂融解消失，肌節(jié)結構不清，肌絲溶解減少，Z線可見異常收縮帶；肌漿網橫小管擴張，偶見胞內脂滴形成。見圖1B。

2.1.3 HP組心肌細胞超微結構變化HP組心肌細胞線粒體大部分輕度腫脹，嵴模糊，嵴間出現透亮低密度影，線粒體膜完整，細胞核輕度皺縮，核膜完整；肌絲輕度稀疏，偶見斷裂溶解，肌絲排列基本整齊，Z線較清；肌漿網橫小管輕度擴張。見圖1C。

2.1.4 ZnP組心肌細胞超微結構變化ZnP組心肌細胞線粒體大部分輕度腫脹，嵴排列稀疏，嵴間可見輕度透亮區(qū)，肌絲改變不明顯，細胞核輕度改變，肌漿網橫小管輕度擴張。見圖1D。

圖1 各組心肌細胞超微結構電鏡觀察

2.2 大鼠心肌細胞線粒體評分結果根據Flameng評分標準對各組線粒體進行評分，N組心肌細胞線粒體結構正常，評分以0分為主；H/R組心肌線粒體損傷以3～4分為主，損傷最嚴重；HP組和ZnP組評分以2～3分為主，損傷程度介于N組和H/R組之間。N組、HP組、ZnP組線粒體評分[（0.25±0.44）、（1.13±0.44）、（1.23±0.45）分]較H/R組[（3.33±0.65）分]低，差異有統計學意義（P＜0.05）；HP組與ZnP組線粒體評分比較，差異無統計學意義（P＞0.05），但均高于N組，差異有統計學意義（P＜0.05）。

3 討論

目前研究認為，缺血/藥物預處理是缺血心臟強而有效的內源性保護現象，可以減輕缺血再灌注后心肌壞死與心肌功能障礙，減少惡性心律失常的發(fā)生，促進血管再生[3]。內源性心臟保護的機制主要是通過誘導觸發(fā)多種內因子釋放，經多條細胞內信號轉導途徑的介導[如：由磷脂酰3激酶（PI3K）-蛋白激酶B（Akt）、P38、c-Jun氨基末端激酶（JNK）及細胞外信號調節(jié)激酶（ERK）等組成的RISK及蛋白激酶C（PKC）等途徑]，作用于多種效應器，影響氧自由基產生、鈣超載、心肌細胞凋亡等缺血再灌注損傷的關鍵環(huán)節(jié)而發(fā)揮心肌細胞保護作用[4]。近年來外源性鋅預處理用于對抗缺血再灌注對心肌損傷的研究越來越多，鋅在藥物預處理中的顯著效果越來越受到重視。

鋅作為人體內重要的微量元素，在人體各項生命活動中發(fā)揮著重要作用。鋅離子是構成機體各種酶、蛋白、轉錄因子等結構和功能的基礎[5]，鋅與生物膜的穩(wěn)定性、抗氧化活性、基因表達調控、細胞免疫、細胞凋亡及其毒性作用等相關[6]。因此，鋅離子在體內的失衡和紊亂都會對機體產生嚴重損害。目前隨著研究的深入，有研究者發(fā)現鋅預處理心肌可對缺血再灌注心肌產生改善心肌能量代謝、減輕鈣超載，抑制炎性反應的作用[7]；鋅與維生素E同食可抑制抗凋亡基因Survivin[8]、Caspase-3[9]與心肌凋亡促進因子Smac[10]的表達，從而達到抑制心肌細胞凋亡的作用。鋅指蛋白ZFP580[11]、心肌缺血預適應上調蛋白1（Mipu1）[12]等鋅依賴蛋白的上調均可在MIRI修復過程中發(fā)揮心肌保護作用。在臨床醫(yī)療中，宋瑞等[13]研究發(fā)現，使用葡萄糖酸鋅片進行術前補鋅能減輕先天性心臟病患兒體外循環(huán)心內直視手術MIRI。以上幾項研究結果的發(fā)現都與微量元素鋅的存在密不可分，可見鋅在對抗MIRI過程中有著舉足輕重的地位。

細胞的超微病理改變是反映細胞損傷和修復最直觀、最有效的指標[14-15]。本研究電鏡超微結構變化顯示，H/R組心肌細胞出現線粒體排列紊亂，基膜基板不清楚，線粒體普遍腫脹，空泡或囊泡化，外膜不完整，嵴減少、不規(guī)則或斷裂成絮狀，部分線粒體損傷嚴重、破裂、溶解；細胞核形狀不規(guī)則，核內染色質凝集，核膜溶解消失，心肌肌原纖維排列紊亂且大面積斷裂融合消失，肌節(jié)結構不清，肌絲溶解減少，Z線可見異常收縮帶，肌漿網擴張等一系列的損傷表現。這一結果與徐鵬等[16]的研究結果相似，說明本實驗的缺氧/復氧模型成功建立。ZnSO4預處理之后的心肌細胞在進行缺氧/復氧以后，心肌細胞超微結構的損傷程度較單純H/R組輕。說明本實驗從形態(tài)學角度證明硫酸鋅預處理對原代培養(yǎng)成年大鼠心肌細胞缺氧/復氧損傷具有一定的保護作用。

缺血再灌注可通過多種途徑造成心肌細胞線粒體損傷，線粒體在細胞凋亡的過程中起著樞紐作用[17]。因此，線粒體超微結構的改變在心肌細胞缺氧/復氧損傷中是評判心肌細胞損傷程度的重要指標。而線粒體Flameng評分正是對線粒體超微結構改變的半定量評定。本研究結果中ZnP組線粒體Flameng評分明顯低于H/R組。這一結果從形態(tài)學角度證明了鋅預處理對心肌細胞缺氧/復氧造成的線粒體損傷具有一定的保護作用。然而其具體保護機制卻錯綜復雜，本研究未對其作用機制進行研究分析，因此，還需要在以后的科研工作中進一步挖掘探索。

與HP組比較，ZnSO4對心肌細胞超微結構產生了與其相當的保護效果。因此，從形態(tài)學角度推測，ZnSO4預處理可替代缺氧預處理，對缺氧/復氧心肌細胞產生保護作用。但是這2種預處理方式之間是否通過共同的作用機制產生保護作用還有待進一步研究。

綜上所述，缺氧/復氧可造成成年大鼠心肌細胞和線粒體超微結構的損傷，ZnSO4預處理能夠明顯減輕缺氧/復氧對心肌細胞及線粒體超微結構的損傷，而且保護效果與缺氧預處理效果相似，證實微量元素鋅可改善缺氧復氧對心肌細胞產生的損傷，具有保護心肌的作用。

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Effects of zinc sulfate pretreatment on cardiomyocytes ultrastructure of adult rats with hypoxia/reoxygenation injury

Hou Weibo，Zhang Yongguo，Wang Ying，Wang Haiying，Yu Tian
（Department of Anesthesiology，Zunyi Medical College，Guizhou，Zunyi 563003，China）

ObjectiveTo approach the effects of zinc sulfate pretreatment on cardiomyocytes ultrastructure of adult rats with hypoxia/reoxygenation injury.MethodsAdult SD rats cardiomyocytes were cultured in vitro and hypoxia/reoxygenation injury models were established，which were randomly divided into 4 groups，including the normal group（group N），the hypoxia/reoxygennation group（group H/R），the hypoxic preconditioning group（group HP）and the znic sulfate（ZnSO4）preconditioning group（group ZnP）.Each group was managed with different intervening measures.In the end，the ultra-structure of cardiomyocytes in each group after hypoxia/reoxygenation could be observed by a transmission electron microscope and scored with mitochondria.ResultsThe ultrastructure of group N，group HP and group ZnP were much better than those of H/R group，and the mitochondria scores of the above-mentioned three groups were lower than those of group H/R whose difference was statistically significant（P＜0.05）.There was no statistical significance in ultrastructure variation and mitochondria score between the group HP and the group ZnP（P＞0.05），but these results were higher than those of group N，whose difference was statistically significant（P＜0.05）. ConclusionHypoxia/reoxygenation is able to cause injury to the cardiomyocytes′ultrastructure of adult rats.ZnSO4precondioning could reduce the cardiomyocytes ultrastructure damage，and the effect is equal to traditional hypoxic preconditioning.

Myocytes，cardiac；Zinc sulfate；Rats；Mitochondria；Ultrastructure；Hypoxia/reoxygennation injury

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.05.007

:A

:1009-5519（2015）05-0657-03

2014-11-25）

貴州省科技支撐計劃項目（黔科合SY[2011]3015）。

侯偉波（1989-），男，陜西咸陽人，碩士研究生，主要從事心肌保護研究；E-mail：806752595@qq.com。通訊作者：王海英（E-mail：wanghaiting-8901@163.com）。