宮頸鱗癌組織中血管生成擬態(tài)及HIF-1α的表達

黃小環(huán)，向麗，龔莉，周鐵軍

（1.瀘州醫(yī)學院附屬醫(yī)院病理科，四川瀘州646000；2.瀘州醫(yī)學院病原生物學教研室，四川瀘州646000）

宮頸鱗癌組織中血管生成擬態(tài)及HIF-1α的表達

黃小環(huán)1，向麗2，龔莉1，周鐵軍1

（1.瀘州醫(yī)學院附屬醫(yī)院病理科，四川瀘州646000；2.瀘州醫(yī)學院病原生物學教研室，四川瀘州646000）

目的研究宮頸鱗癌組織中是否存在血管生成擬態(tài)（VM），以及其與缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）與宮頸鱗癌發(fā)生發(fā)展浸潤轉(zhuǎn)移的關(guān)系和臨床意義。方法收集2010年1月至2011年12月瀘州醫(yī)學院附屬醫(yī)院經(jīng)病理證實為人宮頸鱗癌組織石蠟標本67例，進行CD34/過碘酸雪夫染色（PAS）雙重染色檢測是否存在VM；采用免疫組化檢測HIF-1α在宮頸鱗癌組織中的表達，分析VM與HIF-1α的相關(guān)性及臨床病理特征。另隨機選擇同期因子宮肌瘤行子宮全切手術(shù)的正常宮頸組織標本20例作為對照。結(jié)果宮頸鱗癌組織中VM和HIF-1α陽性率分別為38.81%（26/67）、64.18 %（43/67），顯著高于正常宮頸組織[0（0/20）]，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；不同病理分級、國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIGO）分期及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者宮頸鱗癌組織中VM陽性率比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。不同腫瘤大小及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者HIF-1α陽性率比較，差異也均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。VM與HIF-1α呈正相關(guān)（r=0.339，P＜0.05）。結(jié)論宮頸鱗癌組織中存在VM、HIF-1α高表達可能促進VM的形成，可能共同促進宮頸鱗癌的浸潤和轉(zhuǎn)移。

宮頸腫瘤；癌，鱗狀細胞；缺氧誘導因子1，α亞基；免疫組織化學；血管生成擬態(tài)

充足的血液供應(yīng)是實體腫瘤生長、局部浸潤和遠處轉(zhuǎn)移的前提?，F(xiàn)有的研究表明，腫瘤的血液供應(yīng)方式主要有血管生成、馬賽克血管和血管生成擬態(tài)（VM）3種[1]。其中VM是一種新的腫瘤微循環(huán)模式，可以模擬內(nèi)皮依賴性血管的形態(tài)結(jié)構(gòu)，為腫瘤提供營養(yǎng)。在多種實體腫瘤中發(fā)現(xiàn)VM的存在，而且與預(yù)后相關(guān)，低氧環(huán)境有利于VM的形成。缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）是在缺氧微環(huán)境進行適應(yīng)性反應(yīng)的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，通過調(diào)節(jié)腫瘤細胞的物質(zhì)代謝、細胞增殖、誘導腫瘤血管的形成，促進腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移。本實驗擬研究宮頸癌中是否存在VM，并通過免疫組化檢測HIF-1α在宮頸鱗癌組織中的表達，研究二者與宮頸鱗癌發(fā)生發(fā)展、浸潤轉(zhuǎn)移的關(guān)系及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 一般資料收集2010年1月至2011年12月瀘州醫(yī)學院附屬醫(yī)院手術(shù)切除經(jīng)病理證實為宮頸鱗癌的組織標本67例。所有患者病歷資料保存完整，均為首次發(fā)病，術(shù)前均未接受放、化療?；颊吣挲g24～65歲，平均（43.67±8.14）歲。依據(jù)國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIGO，2000年）的臨床分期：Ⅰ期36例，Ⅱ期31例；腫瘤大于4 cm 27例，腫瘤小于或等于4 cm 40例；按WHO組織學分類標準：角化型21例，非角化型46例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移29例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移38例。另隨機選擇同期因子宮肌瘤行子宮全切手術(shù)的20例健康宮頸組織標本作為對照。所有標本均經(jīng)4%中性甲醛固定，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片。

1.1.2 主要試劑鼠抗人CD34單克隆抗體購于上?；蚩萍脊?，兔抗人HIF-1α多克隆抗體購于美國Bioworld Technolog公司。Envision試劑盒購于Dako公司。過碘酸雪夫染色（PAS）染液按照《病理學技術(shù)》[2]自行配制。

1.2 方法

1.2.1 CD34/PAS雙重染色將石蠟切片脫蠟至水，高壓修復后3%過氧化氫（H2O2）消除內(nèi)源性過氧化物酶，滴加CD34單克隆抗體（1∶100）孵育并過夜，嚴格按Envision二步法免疫組化試劑盒說明書操作，DAB顯色后，按照PAS操作步驟進行，蘇木素復染，梯度脫水后中性樹膠封片。

1.2.2 免疫組化染色采用免疫組化Envision二步法，將石蠟切片脫蠟至水，高壓修復后3%H2O2消除內(nèi)源性過氧化物酶，滴加HIF-1α多克抗體（1∶100）孵育并過夜，滴加Envision二抗37℃孵育2 h，DAB顯色，蘇木素復染，梯度脫水后中性樹膠封片。

1.2.3 免疫組化結(jié)果判斷所有免疫組化染色結(jié)果均由2位病理醫(yī)生在不知病例資料的情況下盲法閱片判斷，對每張切片至少在高倍鏡（400×）下觀察10個不重復視野來判斷結(jié)果。參照文獻[2]標準采用半定量方法將染色強度分為4級進行評分：不著色為0分，黃色為1分，棕黃色為2分，黃褐色為3分。將陽性細胞的比例也分為4級進行評分：陽性細胞數(shù)小于10%為0分，10%～＜40%為1分，40%～＜70%為2分，≥70%為3分。2種評分相加，0～1分為（-），2分為（+），3～4分為（++），5～6分為（+++）。統(tǒng)計時（-）為陰性，其余為陽性。

1.2.4 VM判斷每張切片光鏡下隨機選擇10個無重疊視野進行觀察計數(shù)，將CD34染色陽性的管腔判定為內(nèi)皮血管；CD34染色陰性的管腔，并外附淡紅色（PAS陽性）的細胞外基質(zhì)，結(jié)合蘇木素-伊紅染色（HE染色）證實管壁為腫瘤細胞圍成，判定為VM陽性。

1.3 統(tǒng)計學處理應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料以率或構(gòu)成比表示，采用χ2檢驗，采用Spearman進行相關(guān)性分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 宮頸鱗癌組織中是否存在VM通過HE染色顯示，腫瘤細胞圍成的管道樣結(jié)構(gòu)，部分管腔內(nèi)可見紅細胞，但未見腫瘤性壞死及炎癥細胞。CD34/PAS雙重染色顯示，PAS陽性物質(zhì)厚薄不一，形成管壁樣結(jié)構(gòu)，呈長條形、不規(guī)則形及環(huán)狀，將腫瘤細胞和紅細胞分開，管道樣結(jié)構(gòu)CD34染色未見陽性信號，提示沒有內(nèi)皮細胞。VM主要出現(xiàn)在少血管或無血管區(qū)域，在血管豐富區(qū)域未見VM。67例宮頸鱗癌組織標本中26例檢測到VM，陽性率為38.81 %（26/67），20例健康宮頸組織中未見VM[0（0/20）]，二者比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.2 宮頸鱗癌組織中HIF-1α表達HIF-1α主要表達在細胞質(zhì)中，部分在細胞核。67例宮頸鱗癌組織中43例有陽性信號，陽性率為64.18%（43/67），20例健康宮頸組織中HIF-1α無表達[0（0/20）]，二者比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表1 宮頸鱗癌組織中VM和HIF-1α的表達與臨床病理特征的關(guān)系[n（%）]

2.3 宮頸鱗癌組織中VM和HIF-1α與臨床病理特征的關(guān)系不同年齡、腫瘤大小患者宮頸鱗癌組織中VM陽性率比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；但不同病理分級、FIGO分期及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者宮頸鱗癌組織中VM陽性率比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。不同年齡、病理分級和FIGO分期患者HIF-1α陽性率比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；但不同腫瘤大小及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者HIF-1α陽性率比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

2.4 宮頸鱗癌組織中VM與HIF-1α的相關(guān)性宮頸鱗癌組織中VM陽性的標本中，HIF-1α陽性率為84.62%（22/26）；VM陰性的標本中，HIF-1α陽性率為51.22%（21/41），二者比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。宮頸鱗癌組織中VM與HIF-1α呈正相關(guān)（r=0.339，P＜0.05）。見表2。

表2 宮頸鱗癌組織中VM與HIF-1α的相關(guān)性（n）

3 討論

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率為12.96/10萬[3]。隨著宮頸脫落細胞學檢查的運用，早期宮頸癌及癌前病變的檢測率有所增加，但隨著生活習慣和方式的改變，宮頸浸潤癌的發(fā)病率有所提高且有年輕化趨勢。宮頸鱗狀細胞癌是宮頸癌最常見的組織學類型，預(yù)后較差。因此，研究宮頸鱗癌發(fā)生發(fā)展、浸潤轉(zhuǎn)移的機制，對臨床治療具有積極的意義。

誘導腫瘤血管的形成是腫瘤的固有特性。通過形成腫瘤血管，不但為腫瘤生長提供營養(yǎng)，同時，新生的腫瘤血管壁發(fā)育尚未完善，通過新生血管壁，腫瘤細胞易進入血管腔而發(fā)生浸潤和轉(zhuǎn)移[4]。傳統(tǒng)認為，腫瘤的血液供應(yīng)均是通過血管腔提供，但是Maniotis等[5]在對眼葡萄膜黑色素瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織內(nèi)通過PAS可以見到粉紅色物質(zhì)，呈長條形、不規(guī)則形及環(huán)狀，厚薄不一，形成管壁樣通道，CD34、CD31等內(nèi)皮細胞標記染色為陰性。血液在無內(nèi)皮細胞的通道中運行，提出了VM這一特殊的血液供應(yīng)方式。在對多種實體腫瘤，特別是高度惡性的實體腫瘤的觀察中均發(fā)現(xiàn)了VM[6-8]。本研究結(jié)果顯示，通過HE染色顯示腫瘤細胞圍成的管道樣結(jié)構(gòu)，部分管腔內(nèi)見紅細胞，但內(nèi)未見腫瘤性壞死及炎癥細胞；CD34/PAS雙重染色顯示，PAS陽性物質(zhì)厚薄不一，形成管壁樣結(jié)構(gòu)，呈長條形、不規(guī)則形及環(huán)狀，管道樣結(jié)構(gòu)CD34染色陰性。正常宮頸組織中沒有見到PAS陽性結(jié)構(gòu)。VM主要分布在少血管或無血管區(qū)域，在血管豐富區(qū)域未見到VM的形成。提示宮頸鱗癌組織中存在VM。宮頸鱗癌組織中VM與患者腫瘤大小、年齡無關(guān)，與FIGO分期、組織學分級及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示VM可作為判斷預(yù)后的重要指標之一。

有研究表明，腫瘤微環(huán)境的改變在腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移過程中起著重要作用，而且也可能在VM的形成中起著重要作用，缺氧是其重要的組成成分之一[9-10]。腫瘤的生長需要持續(xù)供養(yǎng)，氧氣在組織中以100～180 μm的速度緩慢擴散，遠遠不能滿足腫瘤快速生長，導致腫瘤局部處于缺氧的狀態(tài)[11]。HIF-1α是近年來發(fā)現(xiàn)的重要的缺氧標志物之一[12]。在缺氧狀態(tài)下，HIF-1α被激活后可調(diào)節(jié)下游多種靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而對維持腫瘤細胞的無氧代謝，促進新生血管生成，進而在促進腫瘤成活、生長和轉(zhuǎn)移等起到重要作用[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α在宮頸鱗癌組織中的陽性率為64.18%（43/67），與正常宮頸組織比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），且與患者年齡、組織分化和FIGO分期無關(guān)，與淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移、腫瘤大小有關(guān)，提示HIF-1α在宮頸鱗癌的發(fā)生發(fā)展、浸潤和轉(zhuǎn)移中起著重要作用。同時，通過相關(guān)分析顯示，宮頸鱗癌組織中VM與HIF-1α呈正相關(guān)。其機制可能為腫瘤快速增長使腫瘤組織內(nèi)血管供血不足，為緩解腫瘤組織缺氧狀態(tài)，在內(nèi)皮依賴性血管長入之前，需要一種替代途徑，表現(xiàn)為VM的形成。因此，作者推測HIF-1α在VM的形成過程中起著一定作用。

綜上所述，宮頸鱗癌組織中存在VM，HIF-1α的高表達可能有利于VM的形成。因此，聯(lián)合檢測宮頸癌組織中VM和HIF-1α對判斷宮頸癌發(fā)生發(fā)展及預(yù)后具有重要意義。同時也為開辟腫瘤新的治療途徑提供理論依據(jù)。

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Vasculogenic mimicry in cervical squamous cell carcinoma tissues and the expression of HIF-1α

Huang Xiaohuan1，Xiang Li2，Gong Li1，Zhou Tiejun1
（1.Department of Pathology，the Affiliated Hospital of Luzhou Medical College，Luzhou，Sichuan646000，China；2.Department of Pathogen Biology，Luzhou Medical College，Luzhou，Sichuan 646000，China）

ObjectiveTo study whether the vasculogenic mimicry in cervical squamous cell carcinoma tissues exists，as well as its relationship and clinic pathological parameters between hypoxia-inducible factor-1α（HIF-1α）protein and invasion and metastasis of progress of cervical squamous cell carcinoma.MethodsA total of 67 cervical squamous cell carcinoma resection specimens confirmed by pathology from January 2010 to December 2011 in the Affiliated Hospital of Luzhou Medical College were collected and detected whether it existed VM by CD34/PAS dual immunohistochemical staining.It adopted immunohistochemical staining to detect the expression of HIF-1α protein in cervical squamous cell carcinoma tissues and analyze the association between VM and HIF-1α，as well as its clinic pathological characters.In addition，it selected 20 normal cervical tissues specimens underwent total hysterectomy for uterine fibroid as the control group.ResultsIn the cervical squamous cell carcinoma tissues，the positive expression rate of VM and HIF-1α was respectively 38.81%（26/67），64.18%（43/67），which was distinctively higher than that in the normal cervical tissues[0（0/20）].The difference had statistical significance（P＜0.05）；The formation of VM was associated with the FIGO staging，histology grading and lymphatic metastasis.The difference had statistical significance（P＜0.05）. The positive expression of HIF-1α protein was associated with lymphatic metastasis and cancer size，which was statistically significant in difference（P＜0.05）.There was a positive association between the expression of HIF-1α and VM（r=0.339，P＜0.05）.ConclusionVM exists in cervical squamous cell carcinoma tissues.Overexpression of HIF-1α may induce the formation of VM. VM and jointly promote the invasion and metastasis of cervical squamous carcinoma.

Uterine cervical neoplasms；Carcinoma，squamous cell；Hypoxia-inducible factor 1，alpha subunit；Immunohistochemistry；Vasculogenic mimicry

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.05.003

:A

:1009-5519（2015）05-0645-03

2014-11-19）

四川省教育廳科研基金資助項目（10ZB117）。

黃小環(huán)（1984-），女，重慶云陽人，碩士研究生，主要從事腫瘤病理學研究；E-mail：305549419i@qq.com。

周鐵軍（E-mail：tiejunzh502@163.com）。