雙配體修飾聚合物泡囊的制備及細(xì)胞攝取

·論著·

雙配體修飾聚合物泡囊的制備及細(xì)胞攝取

解方園，俞媛，耿雯倩，鐘延強(qiáng)(第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥劑學(xué)教研室，上海 200433)

[摘要]目的 構(gòu)建一種主動(dòng)靶向的新型納米藥物載體——聚合物泡囊(polymer vesicles，PVs)，并考察其細(xì)胞攝取。方法以馬來(lái)酰亞胺-聚乙二醇-聚乳酸-羥基乙酸共聚物(MAL-PEG-PLGA)為載體材料，通過(guò)自組裝制備PVs，用轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf)與Tet-1對(duì)PVs進(jìn)行修飾，構(gòu)建納米藥物載體(Tf/Tet-1-PVs)。以香豆素-6作為熒光探針包載于藥物載體，考察腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(BCEC)及神經(jīng)細(xì)胞(Neuro-2a)對(duì)載體系統(tǒng)的攝取。結(jié)果PVs粒徑約80 nm，形態(tài)圓整，電鏡觀察具有明顯膜層結(jié)構(gòu)。BCEC細(xì)胞和Neuro-2a細(xì)胞對(duì)Tf/Tet-1-PVs的攝取均顯著優(yōu)于空白對(duì)照組和單配體修飾對(duì)照組。結(jié)論P(yáng)Vs經(jīng)雙配體Tf及Tet-1修飾后可促進(jìn)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞的攝取。

[關(guān)鍵詞]腦靶向；聚合物泡囊；血腦屏障

[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金(81302714)；上海市科委納米專(zhuān)項(xiàng)(11nm0504400)

[作者簡(jiǎn)介]解方園，碩士研究生.Tel：(021)81871288；E-mail：xiefangyuan2013@163.com

[通訊作者]鐘延強(qiáng)，教授，博士生導(dǎo)師.研究方向：生物大分子藥物的控緩釋靶向給藥系統(tǒng)研究.Tel：(021)81871285；E-mail：yqzhong68@163.com

[中圖分類(lèi)號(hào)]R943[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

DOI[]10.3969/j.issn.1006-0111.2015.01.011

[收稿日期]2014-10-11[修回日期]2014-11-25

The preparation and the cell uptake of polymer vesicles modified with dual ligands

XIE Fangyuan，YU Yuan，GENG Wenqian，ZHONG Yanqiang (Department of Pharmaceutics，School of Pharmacy，Second Military Medical University，Shanghai 200433，China)

Abstract[]ObjectiveTo construct an active targeting drug delivery system- polymer vesicles(PVs)，and examined the cellular uptake.MethodsMaleimide- polyethylene glycol-poly(lactic-co-glycolic acid)(MAL-PEG-PLGA)was used as carrier materials to prepare PVs by self-assembling.And then PVs was modified by Tf and Tet-1(Tf/Tet-1-PVs).To evaluate its active targeting，coumarin-6 was used as a fluorescent probe to analyze cellular uptake of PVs for both BCEC and Neuro-2a cells.ResultsPVs was about 80 nm with rounded shape and had obvious film structure.Tf/Tet-1-PVs exhibited a significant role in promoting cellular uptake for both BCEC and Neuro-2a cells compared with control and single ligand-modified group.ConclusionPVs modified with dual ligands could promote the cell uptake for both brain capillary cells and nerve cells.

[Key words]brain targeting；polymer vesicles；blood-brain barrier(BBB)

中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)疾病，包括神經(jīng)退行性疾病及腦部腫瘤等，嚴(yán)重危害著人類(lèi)的健康[1]。然而，由于血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)的存在，絕大多數(shù)治療藥物無(wú)法通過(guò)BBB轉(zhuǎn)運(yùn)至腦內(nèi)[2]。因此，構(gòu)建一種新型的具有腦內(nèi)靶向遞藥作用的載藥系統(tǒng)至關(guān)重要。

納米藥物載體，包括納米粒、脂質(zhì)體、聚合物膠束、樹(shù)形分子復(fù)合物等，對(duì)改善藥物的體內(nèi)穩(wěn)定性、緩釋給藥以及靶向給藥均起到非常重要的作用。脂質(zhì)體是其中應(yīng)用最為廣泛的納米載體，目前上市的藥物中，有阿霉素脂質(zhì)體、紫杉醇脂質(zhì)體和順鉑脂質(zhì)體等[3-6]。這些脂質(zhì)體藥物具有精確的靶向性和較強(qiáng)的緩釋作用，使藥物作用明顯增強(qiáng)，并解決了很多藥物所伴有的毒性以及特殊部位給藥難的問(wèn)題。但是，脂質(zhì)體在應(yīng)用中存在的最大問(wèn)題是穩(wěn)定性差，包括藥物易泄漏、磷脂易氧化和降解等。

聚合物泡囊(polymer vesicles，PVs)[7]是一種新型的納米藥物載體，由嵌段聚合物通過(guò)自組裝制備，外層為雙分子膜層結(jié)構(gòu)，類(lèi)似脂質(zhì)體，但是穩(wěn)定性大大優(yōu)于脂質(zhì)體，其水性?xún)?nèi)核可以包封親水性藥物，外膜層可以包載脂溶性藥物。因此在客分子的包封中具有很大的潛在應(yīng)用價(jià)值。此外，通過(guò)調(diào)節(jié)聚合物的比例及修飾靶向配體，可以構(gòu)建主動(dòng)靶向于特定組織和細(xì)胞的PVs。

本研究合成了可生物降解的嵌段聚合物馬來(lái)酰亞胺-聚乙二醇-聚乳酸-羥基乙酸共聚物(MAL-PEG-PLGA)，以其作為載體材料，通過(guò)自組裝制備了PVs，在PVs表面通過(guò)共價(jià)鍵連接Tf與Tet-1肽，構(gòu)建納米藥物載體(Tf/Tet-1-PVs)。從而增加BBB的轉(zhuǎn)運(yùn)及神經(jīng)細(xì)胞的攝取，實(shí)現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主動(dòng)靶向性。

1儀器與試藥

1.1　儀器

磁力攪拌器(國(guó)華電器有限公司)；R 系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海申生科技有限公司)；萬(wàn)分之一電子天平AL104、十萬(wàn)分之一電子天平BP211D(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司)；核磁共振儀AvanceⅡ600(美國(guó)Bruker公司)；Zeta Sizer Nano ZS激光粒度分析儀(英國(guó)Malvern公司)；透射電鏡JEM-2010(日本JEOL公司)；激光共聚焦掃描顯微鏡(德國(guó)Leica公司)

1.2　試藥

DL-丙交酯、乙交酯(濟(jì)南岱罡生物科技有限公司)；MAL-PEG3500-OH(北京鍵凱科技有限公司)；辛酸亞錫、轉(zhuǎn)鐵蛋白、Traut試劑、香豆素-6、DAPI(美國(guó)Sigma公司)；Tet-1(杭州中肽生化有限公司)；葡聚糖凝膠(Sepharose CL-4B)(瑞典Pharmacia公司)；硼酸鈉、乙二胺四乙酸鈉鹽(EDTA)、多聚甲醛、丙酮、氯仿、氘代氯仿(CDCl3)(中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑分公司)；BCA試劑盒(上海碧云天生物科技研究所)；膽酸鈉(日本東京化學(xué)工業(yè)有限公司)；DMEM培養(yǎng)基、Hank緩沖液、胰酶(美國(guó)Hyclone公司)；胎牛血清、雙抗(美國(guó)Gibco公司)

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1　PVs的制備和表征

2.1.1高分子材料MAL-PEG-PLGA的合成稱(chēng)取一定量DL-丙交酯、乙交酯、MAL-PEG3500-OH，按物質(zhì)的量比為75∶25∶50加入到三頸瓶中，適量辛酸亞錫甲苯溶液催化，抽真空充氮?dú)獗Ｗo(hù)，油浴150 ℃，攪拌48 h，自然靜置至室溫，以氯仿溶解產(chǎn)物，滴加到過(guò)量的甲醇溶液中使產(chǎn)物析出，以過(guò)量冷的甲醇溶液反復(fù)洗滌、沉淀3次，真空干燥72 h，-20 ℃保存。稱(chēng)取少量上述終產(chǎn)物溶于CDCl3中，通過(guò)1H NMR鑒定，對(duì)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析[8]。

2.1.2PVs、Tet-1-PVs、Tf-PVs及Tf/Tet-1-PVs的制備取適量的MAL-PEG-PLGA溶解于1 ml丙酮， 緩慢滴加到PBS(pH7.4)溶液中， 低速攪拌30 min， 靜置4 h， 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去丙酮， 即得PVs。 載香豆素-6的PVs則將香豆素-6同時(shí)溶于丙酮中。

取適量Tet-1溶解于去離子水中，之后加入到PVs溶液中，調(diào)整pH到8.0，避光，充氮?dú)獗Ｗo(hù)，室溫?cái)嚢? h，過(guò)Sepharose CL-4B填充柱，除去游離Tet-1，收集帶有白色乳光的Tet-1-PVs。

將Tf溶解于EDTA(pH8.5)的緩沖液中，按Tf∶Traut試劑摩爾比1∶40混合，避光充氮?dú)獗Ｗo(hù)，室溫?cái)嚢? h，采用PBS為洗脫液，脫鹽除去Traut試劑，即得巰基化的Tf。將上述巰基化的Tf加入到PVs或Tet-1-PVs溶液中，避光，充氮?dú)獗Ｗo(hù)，室溫?cái)嚢? h，過(guò)Sepharose CL-4B填充柱，除去游離Tf，收集帶有白色乳光的Tf-PVs或Tf/Tet-1-PVs。

2.1.3PVs的表征取1 ml PVs溶液，置于粒徑測(cè)量皿中，用激光粒度分析儀測(cè)定PVs的粒徑。將一定量PVs小心滴加到載有碳膜的銅網(wǎng)上，用紅外燈小心緩慢烘干，透射電鏡觀察PVs的形態(tài)。

2.1.4BCA測(cè)定配制濃度分別為0、10、20、30、40、50、60 μg/ml的BSA標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用BCA試劑盒測(cè)定吸光度值建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。然后取等量的PVs、Tet-1-PVs、Tf-PVs及Tf/Tet-1-PVs，用相同方法測(cè)定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算蛋白濃度。

2.2　細(xì)胞培養(yǎng)

腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(BCEC)由第二軍醫(yī)大學(xué)藥理學(xué)教研室芮耀誠(chéng)教授惠贈(zèng)，神經(jīng)細(xì)胞(Neuro-2a)購(gòu)于ATCC細(xì)胞庫(kù)，培養(yǎng)基條件為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(含雙抗)，于37 ℃，5% CO2孵箱中培養(yǎng)。

2.3　細(xì)胞攝取

將BCEC和Neuro-2a以4×105/孔分別接種到玻璃底皿中心圓槽內(nèi)，孵育24 h，待細(xì)胞貼壁后，除去培養(yǎng)基，用Hank緩沖液洗滌3次。分別加入不同的載有香豆素-6的聚合物泡囊組(PVs、Tet-1-PVs、Tf-PVs及Tf/Tet-1-PVs)，在4 ℃或37 ℃條件下孵育2 h，除去PVs溶液，用Hank緩沖液洗滌5次，4%多聚甲醛固定20 min，DAPI染色10 min，Hank緩沖液再次洗滌5次，于激光共聚焦顯微鏡下觀察。

3結(jié)果

3.1　MAL-PEG-PLGA的合成

1H-NMR對(duì)MAL-PEG-PLGA各官能團(tuán)的歸屬解析如下(圖1)：a為1.65/100萬(wàn)屬于LA結(jié)構(gòu)中的甲基峰，b為3.65/100萬(wàn)屬于PEG結(jié)構(gòu)中的亞甲基峰，c為4.75/100萬(wàn)屬于LA結(jié)構(gòu)中的次甲基峰、d為5.25/100萬(wàn)屬于GA結(jié)構(gòu)中的亞甲基峰，e為6.70/100萬(wàn)屬于MAL結(jié)構(gòu)中的次甲基峰。

根據(jù)MAL-PEG3 500-OH數(shù)均相對(duì)分子質(zhì)量為3 500，即Mn(PEG)=3 500，可通過(guò)3.7/100萬(wàn)左右的PEG結(jié)構(gòu)中的亞甲基峰，4.8/100萬(wàn)左右LA結(jié)構(gòu)中的次甲基峰、5.2/100萬(wàn)左右GA結(jié)構(gòu)中的亞甲基峰峰面積計(jì)算MAL-PEG-PLGA的相對(duì)分子質(zhì)量。計(jì)算公式如下：

LA∶GA=x∶y

n= Mn(PEG)/44

A1：PEG結(jié)構(gòu)中的亞甲基峰峰面積；

A2：LA結(jié)構(gòu)中的次甲基峰峰面積；

44：PEG單體結(jié)構(gòu)-O-CH2-CH2-的相對(duì)分子質(zhì)量；

72：LA單體結(jié)構(gòu)-O-CO-CH(CH3)-的相對(duì)分子質(zhì)量；

58：GA單體結(jié)構(gòu)-O-CO-CH2-的相對(duì)分子質(zhì)量。

將1H NMR中積分結(jié)果代入上式，求得MAL-PEG-PLGA相對(duì)分子質(zhì)量為14 648，LA∶GA=54∶46。

3.2　PVs的粒徑及形態(tài)

動(dòng)態(tài)光散射法測(cè)得PVs粒徑為77.71±2.68 nm，見(jiàn)圖2。透射電鏡觀察PVs 粒徑分布均勻，形態(tài)圓整，具有明顯的外部膜層結(jié)構(gòu)，見(jiàn)圖3。

圖2　PVs的粒徑測(cè)量圖

圖3　PVs的透射電鏡圖(A.×20 000；B.×80 000)

3.3　BCA測(cè)定結(jié)果

BCA法測(cè)得的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為Y=1.067X+0.110 2(r=0.999 8)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算得到PVs、Tet-1-PVs、Tf-PVs及Tf/Tet-1-PVs的蛋白濃度分別為1.64、26.99、44.80、56.05 μg/ml，如圖4所示，與PVs組相比，Tet-1-PVs和Tf-PVs組蛋白濃度顯著增加，而Tf/Tet-1-PVs組最高，表明Tet-1及Tf與PVs成功偶聯(lián)。

古永鏘可以說(shuō)是楊偉東的伯樂(lè)。2012年8月，優(yōu)酷和土豆以100%換股方式合并，古永鏘把昔日的死對(duì)頭納入門(mén)下。2013年3月，古永鏘邀請(qǐng)楊偉東加入優(yōu)酷土豆，并將其空降至土豆網(wǎng)擔(dān)任CEO，土豆創(chuàng)始人王微出局。

圖4　BCA測(cè)定的蛋白濃度

3.4　細(xì)胞攝取

3.4.14 ℃和37 ℃條件下BCEC細(xì)胞和Neuro-2a細(xì)胞攝取激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果顯示，BCEC細(xì)胞(圖5)在4 ℃條件下，所有組的熒光強(qiáng)度都較弱，說(shuō)明溫度對(duì)細(xì)胞的攝取具有影響。在37 ℃條件下，Tf/Tet-1-PVs和Tf-PVs的熒光強(qiáng)度較強(qiáng)，其次是Tet-1-PVs和空白PVs。說(shuō)明PVs可通過(guò)Tf介導(dǎo)增加BCEC細(xì)胞的攝取。

圖5　BCEC細(xì)胞在4 ℃(左)及37 ℃(右)條件下對(duì)載香豆素-6聚合物泡囊的攝取(×630) A.Tf/Tet-1-PVs組；B.Tf-PVs組；C.Tet-1-PVs組；D.空白PVs組

Neuro-2a細(xì)胞(圖6)在4 ℃條件下，類(lèi)似前述BCEC細(xì)胞對(duì)PVs的攝取結(jié)果。在37 ℃條件下，Tf/Tet-1-PVs和Tet-1-PVs的熒光強(qiáng)度較強(qiáng)，其次是Tf-PVs和空白PVs。說(shuō)明PVs可通過(guò)Tet-1介導(dǎo)增加Neuro-2a細(xì)胞的攝取。

圖6　Neuro-2a細(xì)胞在4 ℃(左)及37 ℃(右)條件下對(duì)載香豆素-6 聚合物泡囊的攝取(×630) A.Tf/Tet-1-PVs組；B.Tf-PVs組；C.Tet-1-PVs組；D.空白PVs組

3.4.2游離Tf、Tet-1的競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用在37 ℃條件下，BCEC細(xì)胞中分別加入游離Tf與Tet-1混合物、游離Tf及游離Tet-1的Hank溶液，隨后加入載香豆素-6的Tf/Tet-1-PVs孵育。攝取結(jié)果如圖7所示，加入游離Tf、Tet-1混合物及游離Tf組的熒光強(qiáng)度相比游離Tet-1及空白Hank溶液組明顯降低，說(shuō)明Tf與BCEC細(xì)胞上的受體結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)性抑制了載藥系統(tǒng)的攝取，而游離Tet-1組的競(jìng)爭(zhēng)抑制作用不明顯。

在Neuro-2a細(xì)胞中(圖8)，加入游離Tf和Tet-1混合物及游離Tet-1組的熒光強(qiáng)度相比游離Tf及空白Hank溶液組明顯降低，說(shuō)明Tet-1與Neuro-2a細(xì)胞上的受體結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)性抑制了載藥系統(tǒng)的攝取，而游離Tf組的競(jìng)爭(zhēng)抑制作用不明顯。

圖7　游離Tf、Tet-1對(duì)BCEC細(xì)胞攝取聚合物泡囊的競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用(×630) A.細(xì)胞同游離Tf、Tet-1共孵育然后加入Tf/Tet-1-PVs；B.細(xì)胞同游離Tf共孵育然后加入Tf/Tet-1-PVs；C.細(xì)胞同游離Tet-1共孵育然后加入Tf/Tet-1-PVs；D.細(xì)胞同Hank溶液共孵育然后加入Tf/Tet-1-PVs

圖8　游離Tf、Tet-1對(duì)Neuro-2a細(xì)胞攝取聚合物泡囊的競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用(×630) A.細(xì)胞同游離Tf、Tet-1共孵育然后加入Tf/Tet-1-PVs；B.細(xì)胞同游離Tf共孵育然后加入Tf/Tet-1-PVs；C.細(xì)胞同游離Tet-1共孵育然后加入Tf/Tet-1-PVs；D.細(xì)胞同Hank溶液共孵育然后加入Tf/Tet-1-PVs

4討論

本研究以MAL-PEG-PLGA為載體材料，通過(guò)自組裝制備PVs，制備方法溫和，有利于藥物的包載而且不影響其性質(zhì)，所得粒子結(jié)構(gòu)圓整、粒徑均一。在腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的腔側(cè)具有Tf受體，Tf能夠與受體特異性結(jié)合。當(dāng)Tf與Traut試劑反應(yīng)發(fā)生巰基化后，可以進(jìn)一步與MAL-PEG-PLGA中的馬來(lái)酰亞胺基發(fā)生加成反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)載藥粒子的表面修飾，從而能夠主動(dòng)靶向透過(guò)BBB實(shí)現(xiàn)藥物的腦內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)[9]。Tet-1是最近研究發(fā)現(xiàn)的一種可與神經(jīng)細(xì)胞上的GT1b受體特異性結(jié)合的小肽[10]，其由12個(gè)氨基酸組成，末端半胱氨酸上的巰基可直接與MAL-PEG-PLGA中的馬來(lái)酰亞胺基反應(yīng)，將Tet-1連接于PVs表面，可以實(shí)現(xiàn)載藥系統(tǒng)透過(guò)BBB后對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的二級(jí)靶向作用。細(xì)胞內(nèi)攝取實(shí)驗(yàn)表明，溫度對(duì)兩種細(xì)胞的攝取均有一定的影響。另外，BCEC細(xì)胞對(duì)Tf/Tet-1-PVs和Tf-PVs的攝取量相對(duì)較高，而Neuro-2a細(xì)胞對(duì)Tf/Tet-1-PVs和Tet-1-PVs的攝取量相對(duì)較高。游離的Tf可與BCEC細(xì)胞上的受體結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)性抑制載藥系統(tǒng)的攝取，游離Tet-1可與Neuro-2a細(xì)胞上的受體結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)性抑制載藥系統(tǒng)的攝取。因此，也驗(yàn)證了載體系統(tǒng)經(jīng)配體介導(dǎo)實(shí)現(xiàn)主動(dòng)靶向。

本研究制備了一種新型的聚合物泡囊納米藥物載體，并對(duì)其進(jìn)行雙配體的修飾，以實(shí)現(xiàn)腦部的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)。構(gòu)成BBB的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞以及神經(jīng)細(xì)胞對(duì)所構(gòu)建的載體系統(tǒng)均具有較優(yōu)的攝取。我們將在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中對(duì)載藥系統(tǒng)的體外及體內(nèi)腦靶向性進(jìn)行系統(tǒng)考察。

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[本文編輯]顧文華