利塞膦酸鈉片有關(guān)物質(zhì)的方法學(xué)研究

·論著·

利塞膦酸鈉片有關(guān)物質(zhì)的方法學(xué)研究

張秀立，張宇佳，王璐璐，方夏琴，陳少華，鄭穩(wěn)生(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所藥物傳輸技術(shù)及新型制劑北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050)

[摘要]目的建立測定利塞膦酸鈉片有關(guān)物質(zhì)的高效液相色譜法。方法采用ODS C18色譜柱(5 μm，150 mm×4.6 mm)，以緩沖液(取四丁基溴化銨3.22 g 加入1 000 ml 0.05 mol/L氯化銨緩沖液中，用氨水調(diào)pH至7.8±0.05)-甲醇-乙腈(250:50:25)為流動相；柱溫：室溫；流速：1.0 ml/min；檢測波長：254 nm。結(jié)果在高溫、酸、堿、氧化、強(qiáng)光降解下用HPLC測定，各雜質(zhì)峰和主峰均有較好的分離效果，線性關(guān)系為Y=1.28×107X-1.62×105 (r=0.999 9)，線性良好，穩(wěn)定性良好。結(jié)論該方法測定快速、簡單、準(zhǔn)確，靈敏度高，適用于利塞膦酸鈉片有關(guān)物質(zhì)的測定。

[關(guān)鍵詞]利塞膦酸鈉；有關(guān)物質(zhì)；高效液相色譜法

[基金項(xiàng)目]十一五國家科技重大專項(xiàng)“重大新藥創(chuàng)制”項(xiàng)目(2009ZX09301003-008-001)

[作者簡介]張秀立，實(shí)習(xí)研究員.研究方向：藥物傳輸技術(shù)與新劑型.Tel:15910202937；E-mail:zgrzhangxiuli@163.com

[通訊作者]鄭穩(wěn)生，研究員，碩士生導(dǎo)師.研究方向：藥物傳輸技術(shù)與新劑型.Tel:(010)63165233；E-mail:zhengwensheng@imm.ac.cn

[中圖分類號]R927[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

DOI[]10.3969/j.issn.1006-0111.2015.01.010

[收稿日期]2013-12-11[修回日期]2014-06-30

Determination method of related substances in risedronate sodium tablets

ZHANG Xiuli，ZHANG Yujia，WANG Lulu，F(xiàn)ANG Xiaqin，CHEN Shaohua，ZHENG Wensheng(Key Laboratory of Drug Delivery Technology and Novel Formulations of Beijing，Institute of Materia Medica，Peking Union Medical College，Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing 100050，China)

Abstract[]ObjectiveTo establish a HPLC method for determination of related substances of risedronate sodium tablets.MethodsThe C18 column，5 μm，150 mm×4.6 mm，the buffer solution (3.22 g tetrabutyl ammonium bromide was added to a buffer solution of 1 000 ml 0.05 mol/L ammonium chloride，then adjusted pH to 7.8±0.05 by ammonia) -methanol-acetonitrile =250:50:25 as mobile phase,column temperature：room temperature,flow rate：1.0 ml/min,detection length：254 nm.ResultsDetermined by HPLC at high temperature，acid，alkali degradation，the main peak and the impurity peaks were separated well，and the peaks had a linear relationship，Y=1.28×107X-1.62×105 (r=0.999 9).ConclusionThe method was rapid，simple，accurate and sensitive，and suitable for determination of risedronate sodium tablets related substances.

[Key words]risedronate sodium；related substances；HPLC

利塞膦酸鈉(risedronate sodium)，化學(xué)名為2-(3-吡啶基)-1-羥基乙烷-1，1-雙膦酸酸單鈉鹽，是一種吡啶二膦酸鹽類骨吸收抑制劑。主要通過降低血清中的鈣濃度來保護(hù)骨的吸收從而抑制骨的轉(zhuǎn)化，最終增強(qiáng)骨的骨質(zhì)堅(jiān)固能力。該藥口服吸收迅速，不同部位肌內(nèi)注射給藥吸收差異不大。體內(nèi)消除時(shí)間為6～8 h，大部分從尿中排泄。臨床主要用于骨質(zhì)疏松癥的治療。1998年首次在美國上市， 臨床用于治療變形性骨炎，其后又獲FDA許可用于預(yù)防和治療絕經(jīng)后婦女的骨質(zhì)疏松癥[1，2]。我國目前對利塞膦酸鈉片進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)方法學(xué)的研究較少。為了更加深入準(zhǔn)確地控制利塞膦酸鈉片的質(zhì)量與穩(wěn)定性，參考有關(guān)文獻(xiàn)[3～7]，通過試驗(yàn)確定簡單可行的方法來控制利塞膦酸鈉片的有關(guān)物質(zhì)。

1材料與儀器

利塞膦酸鈉原料、片及對照品(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所研制)?；萜?453紫外分光光度計(jì)(美國惠普公司)；HPLC儀，泵：Waters 515(美國Waters公司)、Waters 2487(美國Waters公司)；ODS C18色譜柱(5 μm，150 mm×4.6 mm)、Thermo BDS Hypersil C18色譜柱 (5 μm，250 mm×4.6 mm)、Acclaiml20 C18色譜柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)。

2方法與結(jié)果

2.1　色譜條件

ODS C18色譜柱，流動相：緩沖液(取四丁基溴化銨3.22 g加入1 000 ml 0.05 mol/L氯化銨緩沖液中，用氨水調(diào)pH至7.8±0.05)-甲醇-乙腈(250:50:25)；柱溫：室溫；流速：1.0 ml/min；檢測波長：254 nm。

2.2　溶液的制備

2.2.1供試品溶液取本品3批，每批10片，研成細(xì)粉，稱取約相當(dāng)于10 mg的利塞膦酸鈉，置10 ml容量瓶中，加水溶解，并稀釋至刻度，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.2對照品溶液取適量利塞膦酸鈉對照品，制成1.0 mg/ml的對照品溶液，其制備方法同供試品溶液。

2.2.3空白溶液按處方比例制備不含利塞膦酸鈉的空白輔料溶液適量，以水為溶劑，配制成相當(dāng)于含利塞膦酸鈉1.0 mg/ml的溶液，即得空白溶液。見圖1(A)。

2.3　有關(guān)物質(zhì)測定

精密量取對照溶液20 μl 注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測靈敏度，使主成分色譜峰的峰高為滿量程的20%～25%；再精密量取供試品溶液和對照溶液各20 μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時(shí)間的2倍。供試品雜質(zhì)峰面積之和與總的峰面積比較，不得大于1.0%。

2.4　專屬性

2.4.1與原料及中間體的分離情況取利塞膦酸鈉對照品，按“2.2.2”項(xiàng)下配制，再取中間體吡啶乙酸適量，加流動相制成每1 ml含50 μg溶液。

2.4.2與降解物的分離情況①高溫降解試驗(yàn)：取利塞膦酸鈉片適量，置150～180 ℃烘箱中，于2.5 h取樣，制成0.5 mg/ml溶液。 ②酸降解試驗(yàn)：取利塞膦酸鈉片適量，加入0.1 mol/L鹽酸，制成1.0 mg/ml供試液，置85～90 ℃水浴中加熱1 h，取出，再加入0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)pH值至7.8。 ③堿降解試驗(yàn)：取利塞膦酸鈉片適量，加入0.1 mol/L NaOH溶液，制成1.0 mg/ml供試液，置85～90 ℃水浴中加熱1 h，取出，再加0.1 mol/L 鹽酸溶液調(diào)pH值至7.8。④氧化試驗(yàn)：取利塞膦酸鈉片適量，加3%雙氧水1 ml，于60 ℃放置6 h后。放冷至室溫，用流動相稀釋制成1.0 mg/ml供試液。⑤強(qiáng)光試驗(yàn)：取在照射度(4500±500) lx的強(qiáng)光下放置10 d的利塞膦酸鈉片適量，用流動相溶解并稀釋制成1.0 mg/ml的供試液。

精密量取利塞膦酸鈉供試品溶液以及上述溶液各20 μl，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件分別進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果表明，利塞膦酸鈉在高溫、光照下較穩(wěn)定，在酸、堿、氧化等化學(xué)反應(yīng)條件下均產(chǎn)生明顯的降解產(chǎn)物，具體見圖 1、2。在所建立的色譜條件下原料、中間體及各降解產(chǎn)物均能與利塞膦酸鈉完全分離，表明本方法具有很好的專屬性。

圖1　利塞膦酸鈉HPLC色譜圖 A.空白輔料；B.對照品；C.中間體吡啶乙酸

圖2　利塞膦酸鈉片專屬性試驗(yàn)色譜圖 A.高溫破壞；B.酸破壞：C.堿破壞：D.氧化破壞；E.強(qiáng)光破壞

2.5　線性及精密度試驗(yàn)

①供試品配制：精密稱取利塞膦酸鈉適量，加水溶解并稀釋至1.5 mg/ml，精密移取此液適量，分別制成濃度約為0.015、0.375、0.750、1.125 mg/ml四梯度溶液，過濾備用。②測定方法：取上述4種不同濃度的溶液各20 μl，進(jìn)樣，并分別記錄色譜圖；每隔2 h重復(fù)進(jìn)樣一次，共5次，考察日內(nèi)差的大小。對最終結(jié)果進(jìn)行處理。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，色譜方法精密度試驗(yàn)良好，供試液穩(wěn)定，日內(nèi)差RSD(%)均不大于2%，在濃度為0.015～1.5 mg/ml范圍內(nèi)進(jìn)樣20 μl，線性良好，r為0.999 9(n=5)，結(jié)果見表1。

表1　利塞膦酸鈉線性及精密度(日內(nèi)差)試驗(yàn)結(jié)果

2.6　最低檢測限

取利塞膦酸鈉約100 mg，精密稱定，加流動相溶解并稀釋成1.0 mg/ml，移取1 ml稀釋至100 ml(10 μg/ml)，再移取此液分別配制濃度為5.0、2.5、1.0 μg/ml的A、B、C 3種溶液，過濾(0.45 μm)備用。調(diào)試色譜儀，待基線平穩(wěn)后進(jìn)樣20 μl，并記錄色譜圖。從色譜圖可知：A、B液能檢出主峰，也能積分；C液則不能檢出主峰(圖3)。本品檢測限按信噪比3:1計(jì)為50 ng。

圖3　利塞膦酸鈉最低檢測限試驗(yàn)HPLC圖譜

2.7　重復(fù)性試驗(yàn)

按“2.2.1”項(xiàng)方法配制取同批共5份供試品溶液，重復(fù)測定，RSD為 1.25%(n=5)，重復(fù)性良好。

2.8　耐用性試驗(yàn)

取同一樣品，依照“2.2”項(xiàng)下制成供試品溶液及對照溶液，使用ODS C18色譜柱、Thermo BDS Hypersil C18色譜柱、Acclaiml20 C18色譜柱3根不同品牌的C18柱，按“2.1”項(xiàng)下方法測定，進(jìn)行耐用性試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明，使用不同品牌的色譜柱對樣品進(jìn)行分析，其分離效果、檢出的雜質(zhì)峰個(gè)數(shù)及有關(guān)物質(zhì)檢查結(jié)果(測得的總雜質(zhì)歸一化含量)基本一致，表明本方法的耐用性較好。

2.9　有關(guān)物質(zhì)測定

分別精密量取供試品溶液20 μl，注入液相色譜儀，記錄峰面積，用歸一化法分別以峰面積計(jì)算，即得利塞膦酸鈉的有關(guān)物質(zhì)含量，見表2。

表2　利塞膦酸鈉片的有關(guān)物質(zhì)測定結(jié)果

3討論

3.1　最佳檢測波長的選擇

取利塞膦酸鈉適量，用流動相配制成濃度為1.0 mg/ml供試品溶液，采取光電二極管陣列檢測器，進(jìn)行全波長掃描，發(fā)現(xiàn)本品的最佳檢測波長為254 nm。

3.2　流動相的篩選

本實(shí)驗(yàn)研究了3個(gè)不同系統(tǒng)的流動相，即純水、甲醇-水系統(tǒng)、磷酸鹽緩沖液-甲醇-乙腈系統(tǒng)。純水系統(tǒng)：試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)主峰出峰時(shí)間太快，約1.8 min，無法與雜質(zhì)分離；甲醇-水系統(tǒng)：試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)主峰出峰時(shí)間2.0 min左右，仍不能有效分離；磷酸鹽緩沖液-甲醇-乙腈系統(tǒng)：試驗(yàn)中采取調(diào)整緩沖液pH值、調(diào)整系統(tǒng)比例等方法，均未取得良好的分離效果。

利塞膦酸鈉為吡啶乙酸與二個(gè)磷酸相連，既有吡啶環(huán)的堿性，又有磷酸基團(tuán)的酸性(且為多元酸)，極性很大，因此采用上述常規(guī)方法，試驗(yàn)結(jié)果不夠理想，故本試驗(yàn)考慮采取離子對試劑，經(jīng)試驗(yàn)篩選，以四丁基溴化銨作為離子對試劑、緩沖液的pH值為7.80±0.05，具體方法為取四丁基溴化銨3.22 g加入1 000 ml 0.05 mol/L氯化銨緩沖液中，用氨水調(diào)pH至7.80±0.05，流動相比例為緩沖液-甲醇-乙腈=250:50:25。

【參考文獻(xiàn)】

[1]杜蕾，馬培奇.第三代雙磷酸鹽類藥物利塞膦酸鈉[J].中國醫(yī)藥情報(bào)，2000，6(3)：1-4.

[2]鄭珩.治療骨質(zhì)疏松癥新藥：risedronate sodium[J].藥學(xué)進(jìn)展，1999，23(3)：181-182.

[3]王婷，張靜霞，程海祺，等.高效液相色譜法測定利福拉齊的有關(guān)物質(zhì)[J].中國抗生素雜志，2012，37(4)：284-319.

[4]劉明潔， 孫華.HPLC法測定利塞膦酸鈉的含量[J].中國藥事，2003，17(3)：178-179.

[5]郝衛(wèi)強(qiáng)，劉文英，狄斌，等. 高效液相色譜法測定利塞膦酸鈉片的含量[J].中國藥科大學(xué)學(xué)報(bào)， 2001，32(4)：286-289.

[6]印平，姚勇，崔麗華，等.利塞膦酸鈉對非骨水泥型全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)后早期股骨假體周圍骨密度的影響[J].中國骨質(zhì)疏松雜志， 2013，19(7)：732-736.

[7]李蔚，馬嘉，張妍，等.利塞膦酸鈉與羥磷酸鹽聯(lián)合應(yīng)用治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的實(shí)驗(yàn)研究[J].西北藥學(xué)雜志， 2012，27(5)：474-475.

[本文編輯]顧文華