鹽霉素鈉納米脂質體的制備及表征

·論著·

鹽霉素鈉納米脂質體的制備及表征

鞏志榮1，何文婷1，孫治國1，郭海霞2，鐘延強1，魯瑩1(1.第二軍醫(yī)大學藥學院，上海 200433；2.解放軍266醫(yī)院，河北 承德 067000)

[摘要]目的 制備并表征鹽霉素鈉納米脂質體(SLN)。方法采用薄膜分散法制備鹽霉素鈉納米脂質體，通過調節(jié)脂質體中膽固醇比例，以鹽霉素鈉包封率為評價指標，篩選鹽霉素鈉納米脂質體的優(yōu)化處方。結果透射電鏡顯示鹽霉素鈉納米脂質體形態(tài)圓整，分散性良好，激光粒度儀顯示鹽霉素鈉納米脂質體平均粒徑為99.0 nm，Zeta電位為-33.5 mV，包封率為85.7%，載藥量為6.7%。通過脂質體包裹，鹽霉素鈉在水中的最高濃度可提高15倍，并證明其具有一定緩釋效果。結論筆者得到了粒徑大小在100 nm左右，形態(tài)均一，包封率和載藥量較高的鹽霉素鈉納米脂質體，為進一步測定其殺傷腫瘤活性奠定了堅實的制劑學基礎。

[關鍵詞]腫瘤干細胞；鹽霉素鈉；脂質體；包封率；處方優(yōu)化

[作者簡介]鞏志榮，碩士研究生.研究方向：藥物緩控釋系統(tǒng)研究.E-mail：shedegongzr@163.com

[通訊作者]魯瑩，博士，副教授.研究方向：藥物緩控釋系統(tǒng)研究.E-mail：acuace@163.com

[中圖分類號]R945[文獻標志碼]A

DOI[]10.3969/j.issn.1006-0111.2015.01.009

[收稿日期]2014-09-27[修回日期]2014-11-16

Preparation and characterization of salinomycin sodium loaded nano liposomes

GONG Zhirong1，HE Wenting1，SUN Zhiguo1,GUO Haixia2，ZHONG Yanqiang1，LU Ying1(1.School of Pharmacy，Second Military Medical University，Shanghai 200433，China；2.No.266 Hospital of PLA,Chengde 067000,China)

Abstract[]ObjectiveTo prepare and characterize salinomycin sodium-loaded nano liposomes(SLN).MethodsThe nano liposomes were prepared by a thin-film dispersion method.The formula of SLN was optimized by regulating the cholesterol ratio of the nano liposomes，using the encapsulation efficacy (EE) of SLN as the primary outcome measure.ResultsTransmission electron microscope (TEM) showed that SLN was round and had a good dispersion.Dynamic laser scatter (DLS) showed that SLN was of a desired size of 99 nm，and zeta potential of -33.5 mV.EE of SLN was 85.7% and drug loading of 6.7%.According to the formulation of nano liposomes，the concentration of salinomycin sodium in water was greatly improved by 15 folds.Additionally，the nano liposomes were observed to exhibit sustained release characteristics.ConclusionSalinomycin sodium-loaded nanoliposomes of a desired size of about 100 nm were obtained，which were well dispersion，and high EE and drug loading.Solid pharmaceutics foundation for the activity examination of SLN was provided in this research.

[Key words]cancer stem cells;salinomycin sodium;liposomes;entrapment efficiency;optimization of preparation

腫瘤干細胞(cancer stem cells)是具有干細胞特性的一個腫瘤細胞亞群，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、耐藥、轉移和復發(fā)中起關鍵作用[1]，消滅腫瘤干細胞有望能徹底治愈腫瘤。因此，許多研究都集中在如何發(fā)現(xiàn)和開發(fā)能靶向腫瘤干細胞的藥物[2]。鹽霉素(salinomycin)是一種環(huán)醚類的離子載體抗生素，2009年Gupta等[3]首次證實鹽霉素能有效靶向乳腺癌干細胞，其消滅乳腺癌干細胞的能力要比傳統(tǒng)化療藥物紫杉醇強100倍。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，鹽霉素能作用于多種腫瘤干細胞(如骨肉瘤、白血病干細胞等)[4]，其作用效果已經(jīng)得到廣泛關注[5]。但是，鹽霉素及其鈉鹽的水溶解度較低，導致其在血液中的濃度難以達到治療濃度，因此亟需通過制劑途徑來提高其血液中的濃度以期獲得更好的治療效果。

納米藥物是指在疾病治療、診斷、監(jiān)控以及生物系統(tǒng)控制等方面應用納米技術而研制的藥物，能顯著提高傳統(tǒng)藥物在血液中的濃度，改善藥物的藥動學、組織分布，提高藥物對靶部位的靶向性[6]。納米脂質體是一種粒徑100 nm左右、由磷脂雙分子層構成的具有水相內核的脂質微囊，它是一種研究最多和最成熟的納米藥物。納米脂質體作為藥物載體，具有良好的生物相容性，可以包載親水性藥物和疏水性藥物，將其作為多種藥物尤其是抗腫瘤藥物的載體，這已在臨床上有所應用[7]。目前FDA已經(jīng)批準多種納米脂質體用于臨床的腫瘤治療[8，9]。

在本研究中，筆者選用氫化大豆卵磷脂、膽固醇和磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000作為脂質體材料，利用薄膜分散法制備鹽霉素鈉脂質體，通過調節(jié)脂質體中的膽固醇比例，以鹽霉素鈉包封率為評價指標，篩選鹽霉素鈉納米脂質體的優(yōu)選處方。

1儀器與材料

1.1　儀器

高效液相色譜儀LC-20A(日本島津公司)，C18反相色譜柱(迪馬公司，250 mm×4.6 mm，5 μm)，旋轉蒸發(fā)儀(上海申生科技有限公司)，薄膜擠出器(加拿大AVESTIN公司)，透射電子顯微鏡(日本JEOL公司)，Zetasizer nano ZS激光粒度分析儀(英國Malvern公司)，超聲波細胞粉碎機(寧波新芝生物科技股份有限公司)，超純水系統(tǒng)(美國Barnstead公司)。

1.2　材料

鹽霉素鈉原料藥(美國TEKU-E公司)，氫化大豆卵磷脂HSPC(德國Lipoid公司)，膽固醇CHOL(美國Sigma公司)，磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000 DSPE-PEG-2K(德國Lipoid公司)。

2方法

2.1　鹽霉素鈉脂質體的制備

鹽霉素鈉脂質體的制備工藝采用傳統(tǒng)的薄膜分散法[10]。具體步驟為：稱取處方中一定比例的各脂質化合物(HSPC∶CHOL∶DSPE-PEG-2K=85∶10∶5，摩爾比)于3 ml三氯甲烷中溶解，按藥脂比1∶10(摩爾比)稱取鹽霉素鈉溶于甲醇，將二者混勻旋蒸為均勻薄膜后，用5 ml HEPES緩沖液水化，即得脂質體溶液粗品。將該粗品超聲震蕩10 min，依次通過0.4、0.2 μm聚碳酸酯膜，即得到鹽霉素鈉脂質體。

2.2　脂質體的表征

采用透射電子顯微鏡觀察脂質體的形態(tài)和粒徑。采用激光粒度分析儀考察脂質體的粒徑分布與Zeta電位分布。將新鮮制備的脂質體進行粒徑、Zeta電位測定后，置4 ℃冰箱存放14 d，重新對其粒徑、Zeta電位進行測定，考察脂質體是否發(fā)生聚集。

2.3　色譜條件

色譜柱：C18反相色譜柱(迪馬公司， 250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈∶水∶四氫呋喃THF∶磷酸H3PO4=85∶10∶5∶0.1 (V/V)；流速：1.5 ml/min；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μl；檢測波長：206 nm。

2.4　鹽霉素鈉的特異性

分別制備以下樣品：A：空白脂質體提取液；B：鹽霉素鈉(SAL-Na)的甲醇標準液；C：空白脂質體加SAL-Na提取液。按2.3項下條件進樣分析，考察SAL-Na提取方法的特異性。

2.5　鹽霉素鈉HPLC-DAD測定方法的建立

精密吸取SAL-Na標準儲備液，用甲醇減半稀釋，分別制備成7.82、15.63、31.25、62.5、125、250、500、1 000 μg/ml的標準系列樣品。按2.3項下條件進樣分析，以峰面積A為縱坐標，樣品濃度C為橫坐標，繪制標準曲線。分別配制500、125、31.25 μg/ml 3個濃度的SAL-Na甲醇溶液，按2.3項下條件連續(xù)進樣5次，考察日內、日間精密度。分別配制500、125、31.25 μg/ml 3個濃度的SAL-Na脂質體混合液，使用甲醇破乳后按2.3項下條件進樣分析，代入標準曲線計算脂質體中藥物的提取回收率。

2.6　包封率、載藥量的測定

采用微型柱離心-HPLC法[11]測定鹽霉素鈉脂質體的包封率和載藥量。微型柱的填充材料為葡聚糖凝膠G-50，根據(jù)分子篩原理，其對游離藥物鹽霉素鈉的吸附遠高于鹽霉素鈉脂質體。具體操作為，取50 μl脂質體樣品進行微型柱上樣，離心3次，得到除去游離鹽霉素鈉的脂質體。該脂質體經(jīng)甲醇破乳，過膜后按2.3項下條件進樣分析。

2.7　鹽霉素鈉脂質體的處方優(yōu)化

固定DSPE-PEG-2K的比例為5%，調節(jié)脂質組成中膽固醇的比例分別為40%、20%、10%，按藥脂比為1∶10投藥制備鹽霉素鈉脂質體，以包封率為評價指標，篩選出鹽霉素鈉脂質體的最優(yōu)處方。

2.8　鹽霉素鈉脂質體體外釋放的考察

分別取1 ml游離鹽霉素鈉和鹽霉素鈉脂質體置于截留相對分子質量為10 000的透析管中，釋放介質為100 ml磷酸鹽緩沖液(PBS：pH=7.4，10 mmol/L)，在37 ℃、100 r/min條件下，于規(guī)定時間點各取2 ml 釋放介質樣品。樣品經(jīng)濃縮后，按2.3項下條件進行鹽霉素鈉含量測定。

3結果

3.1　膽固醇比例對鹽霉素鈉包封率的影響

如表1所示，隨著處方中膽固醇比例的降低，鹽霉素鈉的包封率升高。但是過低的膽固醇，會導致脂質體膜結構流動性過高而降解[12]，不利于藥物的釋放和脂質體的穩(wěn)定。因此，本實驗選擇10%的膽固醇比例作為最優(yōu)處方， 此時鹽霉素鈉脂質體的包封率可達85%，載藥量為6.7%，鹽霉素鈉的濃度可達1.5 mg/ml，其濃度約提高15倍。

表1　膽固醇比例對鹽霉素鈉脂質體包封率的影響

3.2　鹽霉素鈉脂質體的表征

圖1為脂質體的透射電鏡(TEM)圖片。如圖所示，脂質體表觀圓整，脂質雙分子層清晰可見，分布均勻，粒徑約為100 nm。

圖1　脂質體TEM圖(×20 000) A.空白脂質體；B.鹽霉素鈉脂質體

圖2為脂質體的粒徑大小、分散性和Zeta電位典型圖例。由圖可見，脂質體的平均粒徑在100 nm左右，Zeta電位分布在-35 mV附近，顯示該脂質體帶負電，且其絕對值大于25 mV，說明該脂質體穩(wěn)定性好。以氫化大豆卵磷脂作為脂質材料，其相變溫度為55 ℃，在低于此溫度時，該脂質體的流動性較低。因此，該脂質體可在體溫條件下較長時間內保持其形態(tài)，從而保持其穩(wěn)定性。

圖2　脂質體的粒徑分布圖和Zeta電位圖 A 1、B 1.空白脂質體的粒徑分布和Zeta電位分布圖；A 2、B 2.鹽霉素鈉脂質體的粒徑分布和Zeta電位分布圖

表2為新鮮制備的空白脂質體和鹽霉素鈉脂質體以及其在4 ℃冰箱放置14 d后，其粒徑、電位分布的變化。從表中數(shù)據(jù)可知，脂質體在4 ℃條件下，分散性良好，無聚集現(xiàn)象發(fā)生。

表2　脂質體的穩(wěn)定性考察

3.3　鹽霉素鈉特異性

圖3為鹽霉素鈉特異性代表性圖譜，鹽霉素鈉的出峰時間為11.68 min。結果顯示，脂質體材料對鹽霉素鈉的測定無干擾。

圖3　鹽霉素鈉特異性圖譜

3.4　鹽霉素鈉HPLC-DAD測定方法

如圖4所示，鹽霉素鈉質量濃度在7.8~1 000 μg/ml范圍內線性良好，線性方程為A=419.4C-226.7(r=0.999 7)。如表3、表4所示，鹽霉素鈉的日內、日間精密度均小于5%，回收率為99%~107%，符合定量測定要求。鹽霉素鈉在脂質體中的提取回收率為96%~113%，且RSD<5%，因此該破乳條件和測定條件滿足鹽霉素鈉脂質體包封率和載藥量的體外定量測定要求。

圖4　鹽霉素鈉的標準曲線

表3　鹽霉素鈉日內、日間精密度以及回收率

表4　鹽霉素鈉的提取回收率

3.5　鹽霉素鈉脂質體包封率和載藥量的測定

如圖5所示， 對空白脂質體和游離鹽霉素鈉在微型柱上的吸附性進行考察。采用濁度法[13]于500 nm處測定上柱前后空白脂質體的吸光度，按2.6項下條件離心處理，結果顯示4次洗脫離心后，空白脂質體可以被完全洗脫下來。另將游離鹽霉素鈉上樣于微型柱中，按2.6項下條件離心處理，收集所得溶液按2.3項下條件處理并測定藥物含量，計算游離鹽霉素鈉的洗脫百分數(shù)。結果顯示，經(jīng)4次洗脫后，只有不到3%的游離藥物被沖出。因此，利用微型柱離心-HPLC法測定鹽霉素鈉脂質體的包封率及載藥量的結果準確可靠。最終測得優(yōu)選處方中鹽霉素鈉脂質體的包封率為85.7%，載藥量為6.7%。

圖5　微柱對空白脂質體(A)和游離鹽霉素鈉(B)的洗脫曲線

3.6　游離鹽霉素鈉和鹽霉素鈉脂質體的體外釋放度考察

圖6為游離鹽霉素鈉和鹽霉素鈉脂質體在PBS(pH=7.4)中的釋放曲線，結果顯示，鹽霉素鈉經(jīng)脂質體包裹后，具有一定緩釋效果，在48 h內累計釋放量為70%。

圖6　游離鹽霉素鈉和鹽霉素鈉 脂質體的體外釋放曲線

4討論

采取哪種策略來優(yōu)化藥物的吸收、分布、代謝、排泄/毒性(ADME/Tox)，藥物的類藥性質是關鍵。首先，筆者利用ACD在線軟件(https//ilab.acdlabs.com/iLab2/)對鹽霉素鈉的類藥性質進行了分析，發(fā)現(xiàn)鹽霉素鈉親脂性較高，滲透性良好，溶解性較低，吸收程度差。對于這些問題通?？赏ㄟ^制劑途徑來解決。筆者選擇納米脂質體的原因在于它是目前最為成熟的納米藥物劑型，具有良好的應用前景。通過納米脂質體包裹，將鹽霉素鈉在水溶液中的最高濃度提高了15倍，預期能改善鹽霉素鈉的ADME/Tox。

包裹藥物的性質、膽固醇與磷脂的比例和制備方法是脂質體處方工藝的3大要素。① 藥物的log P對選擇何種制備方法至關重要。在本研究中，鹽霉素鈉的油水分配系數(shù)log P為6.1，為脂溶性藥物，因此筆者選擇較為簡單的薄膜分散法來制備鹽霉素鈉脂質體。② 膽固醇被稱為“流動性緩沖劑”，在相變溫度之下，磷脂中加膽固醇可使膜減少有序排列而增加膜流動性；在相變溫度之上，酰鏈自由度減小導致膜壓縮、表面積變小、

包裝緊密性和流動性

降低。在研究中發(fā)現(xiàn)，由于鹽霉素鈉為脂溶性藥物，低膽固醇的脂質組成更易于包載鹽霉素鈉。原因可能有以下兩點：一是鹽霉素鈉與膽固醇均為脂溶性物質，對于脂質體的脂質雙分子層的疏水空間具有競爭性；二是高比例的膽固醇脂質組成使得脂質中的烴鏈流動性降低，從而干擾鹽霉素鈉進入脂質雙分子層[14]。③ 磷脂是生物膜的主要結構成分，選擇氫化大豆卵磷脂HSPC作為脂質體的磷脂膜材是由于其較高的相變溫度(Tm=55 ℃)，在常溫下可以保持脂質體的穩(wěn)定性。長循環(huán)脂質體的制備可以通過在脂質體雙分子層中加入PEG化脂質，或者用嵌段共聚物對囊泡的表面進行修飾。因此，在脂質體中摻入一定比例的DSPE-PEG-2K以期增加脂質體的穩(wěn)定性，延長脂質體的循環(huán)時間。由于DSPE-PEG-2K是一種表面活性劑，其比例超過40%有可能破壞脂質體結構[15]，形成膠束結構。因此，本實驗在脂質體中只摻入5% DSPE-PEG-2K。

文獻中鹽霉素鈉的測定方法多為柱前衍生化法[16]，該方法操作復雜、穩(wěn)定性差。為解決這些問題，本實驗中鹽霉素鈉采用HPLC-DAD的測定方法，該方法操作簡單，測定方法的準確度和穩(wěn)定性能滿足體外鹽霉素鈉的定量要求。

綜上，本實驗得到了粒徑大小在100 nm左右，形態(tài)均一，包封率和載藥量較高的鹽霉素鈉納米脂質體，為進一步測定其殺傷腫瘤活性奠定了堅實的制劑學基礎。

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[本文編輯]顧文華