左乙拉西坦緩釋片在Beagle犬中的生物等效性研究

·論著·

左乙拉西坦緩釋片在Beagle犬中的生物等效性研究

陳仁海，黃曉玲，鄧軼方，劉全海(中國醫(yī)藥工業(yè)研究總院上海醫(yī)藥工業(yè)研究院，上海 200437)

[摘要]目的以Beagle犬為模型考察自制左乙拉西坦緩釋片與參比緩釋片(Keppra XR)在動(dòng)物體內(nèi)的生物等效性。方法Beagle犬分別單劑量口服自制緩釋片與參比制劑1 000 mg，采用LC-MS/MS方法測定犬血漿中左乙拉西坦的濃度，通過藥代動(dòng)力學(xué)計(jì)算軟件WinNonlin 5.2以非房室模型分別計(jì)算左乙拉西坦的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。結(jié)果自制緩釋片與市售參比緩釋片單劑量口服后，左乙拉西坦的達(dá)峰時(shí)間tmax分為1.67 h和3.0 h；峰濃度Cmax分別為89.50 μg/ml和71.18 μg/ml；消除半衰期t1/2分別為3.68 h和3.50 h；藥時(shí)曲線下面積AUC(0-48)分別為826.57 μg·h/ml和757.84 μg·h/ml；藥時(shí)曲線下面積AUC(0-∞)分別為826.68 μg·h/ml和757.93 μg·h/ml。與參比緩釋片相比，自制左乙拉西坦緩釋片的相對(duì)生物利用度為109.07%。結(jié)論初步判定兩種制劑在犬體內(nèi)具有類似的藥代動(dòng)力學(xué)特征和生物等效性。

[關(guān)鍵詞]左乙拉西坦；緩釋片；生物等效性

[作者簡介]陳仁海，博士研究生.Tel:(021)65179533；E-mail:chenrenhai@yahoo.com

[通訊作者]劉全海，研究員，博士生導(dǎo)師.研究方向：新藥研發(fā)和分子藥理學(xué).Tel：(021)65179533；E-mail:liuquanhai_lqh@163.com

[中圖分類號(hào)]R945[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

DOI[]10.3969/j.issn.1006-0111.2015.01.008

[收稿日期]2014-03-28[修回日期]2014-09-17

Bioequivalence of levetiracetam extended-release tablets in Beagle dogs

CHEN Renhai，HUANG Xiaoling，DENG Yifang，LIU Quanhai(Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry，China State Institute of Pharmaceutical Industry，Shanghai 200437，China)

Abstract[]ObjectiveTo study the bioequivalence of two kinds of levetiracetam extended-release tables including the reference product of Keppra XR in Beagle dogs.MethodsDogs were administrated orally with single dose of levetiracetam tablets (1 000 mg).The concentration of levetiracetam in dog plasma was detected by LC-MS/MS.All parameters of pharmacokinetics were performed by WinNonlin 5.2 software.ResultsMain pharmacokinetic parameters of test and reference tablets were as follow：tmax were 1.67 h and 3.0 h,Cmax were 89.50 μg/ml and 71.18 μg/ml,t1/2 were 3.68 h and 3.50 h,AUC(0-48) were 826.57 μg·h/ml and 757.84 μg·h/ml,AUC(0-∞) were 826.68 μg·h/ml and 757.93 μg·h/ml.The relative bioavailability of test tablets was 109.07% to reference products of Keppra XR.ConclusionTherefore，the two kinds of levetiracetam extended-release tablets were bioequivalent in Beagle dogs.

[Key words]levetiracetam；extended-release tablet；bioequivalence

左乙拉西坦是一種新型抗癲癇藥物，具有作用機(jī)制獨(dú)特、療效確切、不良反應(yīng)少、藥代動(dòng)力學(xué)優(yōu)等特點(diǎn)，廣泛運(yùn)用在臨床癲癇治療中。由于癲癇發(fā)病機(jī)制復(fù)雜、患者存在著明顯的個(gè)體差異，只有科學(xué)合理地進(jìn)行藥物治療，才能有效或完全控制癲癇發(fā)作，否則易轉(zhuǎn)化成難治性癲癇，給患者、家庭和社會(huì)帶來很大的心理和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。研究發(fā)現(xiàn)，抗癲癇藥物給藥次數(shù)增加，導(dǎo)致癲癇患者藥物治療的依從性降低和易發(fā)生漏服藥物的現(xiàn)象，從而影響控制患者癲癇發(fā)作，甚至導(dǎo)致治療失敗[1，2]。緩釋制劑不但可減少每日給藥次數(shù)以增加患者依從性，而且能使血藥濃度曲線變得更為平緩，降低血藥濃度的峰谷效應(yīng)，有效減少與峰濃度相關(guān)的不良反應(yīng)，因此緩釋制劑能夠改善病人依從性和提高對(duì)發(fā)作的有效控制，帶來更好的耐受性和治療效果[3，4]。臨床研究表明，左乙拉西坦緩釋片(Keppra XR，500 mg/片，UCB公司)與普通制劑相比能夠更加有效地控制難治性癲癇發(fā)作，也具有更好的依從性和耐受性。迄今，國外已有多家企業(yè)生產(chǎn)的左乙拉西坦緩釋片被美國FDA批準(zhǔn)上市，迅速取得了臨床使用和市場銷售的認(rèn)可，但在國內(nèi)尚未上市和臨床使用，也僅有少數(shù)企業(yè)在進(jìn)口注冊(cè)和申報(bào)臨床批件。

因此，左乙拉西坦緩釋片是目前國內(nèi)臨床治療急需的品種，也具有廣闊的市場前景。本研究采用Beagle犬進(jìn)行藥動(dòng)學(xué)研究，考察自制左乙拉西坦緩釋片與參比制劑Keppra XR的口服生物等效性。

1儀器與試藥

ZPW-5型式壓片機(jī)(上海天和制藥機(jī)械有限公司)；LC Solution 2010 HPLC(島津公司)；質(zhì)譜儀(API4000，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)；電噴霧離子源(ESI)，串聯(lián)四極桿質(zhì)量分析器；數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)為Analyst軟件(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)。

左乙拉西坦原料藥(百靈威科技有限公司)；市售參比左乙拉西坦緩釋片(UCB Pharma SPA，商品名為Keppra XR，規(guī)格500 mg)；華法林(內(nèi)標(biāo)，Toronto Research Chemicals Inc.，含量99%)；自制左乙拉西坦緩釋片(上海醫(yī)藥工業(yè)研究院)；健康Beagle犬(6只，雌雄各半，體重10～12 kg)。

2方法與結(jié)果

2.1　色譜條件

色譜柱：XTerra MS-C18(2.1 mm×50 mm，3.5 μm)；流速：1.0 ml/min；流動(dòng)相：0.1%甲酸水溶液:甲醇(20:80)。

2.2　質(zhì)譜條件

霧化氣：8；氣簾氣(CUR)：8；碰撞氣(CAD)：4；離子源電壓(IS)：5 000 V；離子源溫度(TEM)：500 ℃；質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1　質(zhì)譜參數(shù)

2.3　溶液配制

2.3.1對(duì)照品儲(chǔ)備液精密稱取左乙拉西坦對(duì)照品約5 mg，置10 ml棕色容量瓶中，加甲醇使待測物完全溶解后定容，配制成濃度為500 μg/ml的儲(chǔ)備液。儲(chǔ)備液存放在4 ℃冰箱中待用。

2.3.2華法林儲(chǔ)備液(內(nèi)標(biāo))精密稱取華法林至容量瓶中，加甲醇使待測物完全溶解后定容，配制成濃度為229 μg/ml的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液。儲(chǔ)備液貯存在4 ℃冰箱中待用。

2.4　樣品處理方法

取血漿樣品解凍后放至室溫，渦流混勻，并經(jīng)過空白血漿定量稀釋后加入250 μl內(nèi)標(biāo)溶液(500 ng/ml華法林甲醇溶液，空白溶液內(nèi)不加內(nèi)標(biāo)補(bǔ)加相同體積的甲醇)；樣品渦旋混勻，離心5 min(15 000 r/min)，取上清液150 μl，LC-MS/MS分析。

2.5　專屬性試驗(yàn)

取對(duì)照品溶液、空白血漿溶液，分別進(jìn)樣，LC-MS/MS色譜圖見圖1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，血漿內(nèi)源性成分不干擾藥物及內(nèi)標(biāo)的測定。

圖1　典型LC-MS/MS色譜圖 A.空白血漿；B.空白血漿+左乙拉西坦；C.空白血漿+華法林

2.6　標(biāo)準(zhǔn)曲線和最低定量限

取適量左乙拉西坦對(duì)照品，用甲醇逐級(jí)稀釋，配制成濃度為100、40、20、4、2、0.4 μg/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液，作為儲(chǔ)備液；分別精密量取儲(chǔ)備溶液各5 μl平行加入到195 μl犬空白血漿中，制得濃度為2 500、1 000、500、100、50、10 ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品，分別進(jìn)樣，記錄峰面積。以各組峰面積Y為縱坐標(biāo)，相應(yīng)濃度X為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程，具體見表2和圖2。結(jié)果表明，左乙拉西坦血藥濃度在10~2 500 ng/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，最低定量限為10 ng/ml。

表2　左乙拉西坦在犬空白血漿中線性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖2　左乙拉西坦在犬空白血漿中標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.7　準(zhǔn)確度試驗(yàn)

分別配制低、中、高3個(gè)濃度的樣品，各取6份，按照“2.1色譜條件”測定，計(jì)算回收率。樣品溶液配制方法如下。

2.7.1質(zhì)控樣品配制取空白血漿樣品，室溫自然融化，加入左乙拉西坦對(duì)照品儲(chǔ)備液配制成質(zhì)控樣品(濃度為15、800、2 000 ng/ml，每濃度6份)，渦旋30 s，取50 μl樣品至1.5 ml離心管中，分別加入250 μl內(nèi)標(biāo)溶液渦旋混勻，取上清液進(jìn)樣分析。

2.7.2基質(zhì)樣品配制取空白血漿，加入250 μl甲醇溶液，渦旋60 s后離心5 min(10 000 r/min)，取上清液待用。在195 μl的上清液中，加入5 μl的左乙拉西坦儲(chǔ)備溶液(0.6、32、80 μg/ml)，渦旋30 s混勻。取50 μl樣品至1.5 ml離心管中，分別加入250 μl內(nèi)標(biāo)溶液渦旋混勻，取樣分析，每一濃度水平配制6份。

2.7.3溶液樣品配制取195 μl的甲醇加入5 μl的左乙拉西坦儲(chǔ)備溶液(0.6、32、80 μg/ml)，渦旋60 s，然后按照樣品處理方法處理，每一濃度水平配制6份。

通過質(zhì)控樣品與基質(zhì)樣品藥物峰面積響應(yīng)的比較，以評(píng)價(jià)方法的回收率；通過基質(zhì)樣品與溶液樣品藥物峰面積響應(yīng)的比較，以評(píng)價(jià)方法的基質(zhì)效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在3個(gè)濃度條件下回收率范圍在92.21%~103.55%內(nèi)，本方法回收率良好。

2.8　精密度試驗(yàn)

取“2.7”項(xiàng)下質(zhì)控樣品，分別連續(xù)進(jìn)樣6次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明3個(gè)濃度峰面積RSD為0.04%~2.15%，本方法精密度良好。

2.9　穩(wěn)定性試驗(yàn)

取配制好的質(zhì)控樣品，存放于-80 ℃冰箱中，24 h后取出，室溫下自然融化，當(dāng)樣品完全溶解后再次存放于-80 ℃冰箱冷凍。如此反復(fù)凍融，在第3次融化以后進(jìn)行分析。結(jié)果表明，3個(gè)濃度樣品經(jīng)-80 ℃條件下放置24 h后，含量測定RSD為1.94%~3.44%，表明本樣品穩(wěn)定性良好。

2.10　藥動(dòng)學(xué)研究

2.10.1給藥方案6只Beagle犬隨機(jī)分為2組，每組3只，給藥前禁食過夜(12~16 h)。分別給予口服參比制劑Keppra XR 2片(500 mg/片)或自制緩釋片1片(1 000 mg/片)，將給藥前記為0點(diǎn)，給藥后的0.25、0.5、0.75、1、2、3、4、6、8、24、48 h在犬頸靜脈取血約1 ml。所取血樣均置肝素化離心管中，離心(3 500 r/min)10 min后分離血漿，-20 ℃冰箱保存，備測。

2.10.2血藥濃度測定方法LC-MS/MS分析方法驗(yàn)證結(jié)果表明，擬定分析方法完全能滿足血液樣品中左乙拉西坦含量的測定，可運(yùn)用于該藥的非臨床藥動(dòng)學(xué)研究。從冰箱中取出樣品(-80℃)，室溫自然融化后渦旋30 s，取10 μl加入40 μl空白血漿中混勻，再取其中10 μl加入90 μl空白血漿中。進(jìn)行上述兩次稀釋后，取出50 μl加入250 μl內(nèi)標(biāo)溶液(500 ng/ml華法林甲醇溶液)混勻，離心5 min(15 000 r/min)，取上清液150 μl，采用擬定分析方法，測定血樣中左乙拉西坦含量，藥-時(shí)曲線見圖3。

圖3　兩種左乙拉西坦緩釋片在犬體內(nèi)平均藥-時(shí)曲線

2.10.3藥動(dòng)學(xué)研究結(jié)果根據(jù)藥物的血藥濃度數(shù)據(jù)，使用藥動(dòng)學(xué)計(jì)算軟件WinNonlin 5.2以非房室模型分別計(jì)算左乙拉西坦的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，結(jié)果表明，自制緩釋片與市售參比緩釋片(Keppra XR)單劑量口服后，左乙拉西坦的達(dá)峰時(shí)間tmax分別為1.67 h和3.0 h；峰濃度Cmax分別為89.50 μg/ml和71.18 μg/ml； 消除半衰期t1/2分別為3.68 h和3.50 h；藥時(shí)曲線下面積AUC(0-48)分別為826.57 μg·h/ml和757.84 μg·h/ml；藥時(shí)曲線下面積AUC(0-∞)分別為826.68 μg·h/ml和757.93 μg·h/ml。雙單側(cè)t檢驗(yàn)結(jié)果顯示Cmax和AUC(0-48)的P值分別為0.091和0.26，均大于0.05，表明自制品與市售品的Cmax和AUC(0-48)無顯著性差異，其中自制緩釋片的AUC值均落在參比制劑(Keppra XR)的80%~125%之內(nèi)，Cmax值落在參比制劑的75%~133%之內(nèi)，見表3。

表3　兩種左乙拉西坦緩釋片在犬體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)研究

3討論

本研究建立了測定Beagle犬體內(nèi)左乙拉西坦的LC-MS/MS方法。經(jīng)驗(yàn)證，方法簡便、專屬性好、靈敏度高，適用于血漿中左乙拉西坦的濃度測定及藥動(dòng)學(xué)研究[5]。研究結(jié)果表明，自制的左乙拉西坦緩釋片與參比制劑Keppra XR沒有顯著性差異，且藥-時(shí)曲線高度重合。自制緩釋片的相對(duì)生物利用度為109.07%，初步判定自制緩釋片具有與參比制劑(Keppra XR)相類似的動(dòng)物體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)特征。

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[本文編輯]顧文華