重組鏈球菌溶血素(SLO)的原核表達、純化

鐘佳蕓，張 濤

1成都外國語學(xué)校；2成都醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)系

重組鏈球菌溶血素(SLO)的原核表達、純化

鐘佳蕓1，張 濤2

1成都外國語學(xué)校；2成都醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)系

目的構(gòu)建SLO原核表達質(zhì)粒，重組蛋白的誘導(dǎo)表達并純化。方法提取鏈霉菌溶血素O模板DNA,PCR法擴增slo基因。構(gòu)建融合表達重組質(zhì)粒pGEX-6p-1-slo和pet32a-tev-slo，將正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21和大腸桿菌BL21-DE3,使用異丙基硫代βD半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)表達重組融合蛋白。采用親和層析純化重組蛋白，切除標(biāo)簽后，再通過親和層析純化，獲取SLO重組蛋白。結(jié)果PCR擴增出slo基因，基因片段（1700 bp）與理論一致。經(jīng)SDSPAGE,蛋白質(zhì)印跡顯示重組蛋白相對分子質(zhì)量為55 kDa，與數(shù)據(jù)庫中的相對分子質(zhì)量結(jié)果相符。結(jié)論成功構(gòu)建了slo原核表達質(zhì)粒，表達并純化了SLO重組蛋白。

鏈霉菌溶血素O；原核表達；蛋白質(zhì)純化

1 引言

鏈球菌溶血素是由A群鏈球菌產(chǎn)生的一種外毒素，能溶解紅細胞，并對機體多種細胞有毒性作用。鏈球菌溶血素主要有鏈球菌溶血素“O”(SLO)和鏈球菌溶血素“S”（SLS）兩種[1]。其中SLS多數(shù)是由A、C、G群鏈球菌產(chǎn)生，是一種小分子糖肽，不具有免疫原性，在養(yǎng)存在的條件下穩(wěn)定的存在，但是對熱和酸較為敏感。

鏈球菌溶血素“O”(SLO),基因大小為1700 bp左右，緊跟著spn基因。所表達的蛋白相對分子量為55 kDa,大部分是由A群鏈球菌產(chǎn)生的，SLO釋放前主要存在于細菌的細胞壁和細胞膜之間的周圍包漿中[2]，在細菌的對數(shù)期及穩(wěn)定期釋放[3]，因此可以看出釋放SLO的鏈球菌對營養(yǎng)要求較高。SLO蛋白的等電點為6.0-6.4，主要由十七種氨基酸組成，主要以天冬氨酸、賴氨酸以及谷氨酸為首，組氨酸和半胱氨酸以及脯氨酸較少，不存在酪氨酸。SLO是含有-SH的蛋白質(zhì)，因此具有強烈的異質(zhì)性，對氧十分的敏感，在氧存在的情況下-SH被氧化成-SS-基，暫時失去溶解細胞的功能，因此又被稱之為SH-激活細胞溶素，它通過與靶細胞膜表面相應(yīng)的膽固醇受體不可逆的相互作用，從而與靶細胞結(jié)合，單體發(fā)生寡聚化，形成環(huán)狀的前孔結(jié)構(gòu)，然后發(fā)生構(gòu)象改變，從而前孔插入膜中，最終在靶細胞膜上形成跨膜的大型兩性β-桶狀孔道，這一結(jié)構(gòu)賦予其“造孔”的特殊功能[4]。此桶裝孔道大約有25-30納米大小。溶紅細胞活性是SLO的特殊生物活性，以HU來表示，據(jù)推算一百個SLO分子可以溶解一個紅細胞。SLO的溶細胞效應(yīng)高度的依賴膽固醇。細胞膜上的膽固醇不僅是SLO的結(jié)合位點，也是其靶點[3,5]。SLO的溶細胞活性可以被鋅離子和鈣離子所抑制，鋅離子和鈣離子主要通過與SLO的琉基發(fā)生反應(yīng)，從而發(fā)揮抑制作用。SLO的抗原性極強，感染此種鏈球菌后2～3周內(nèi)，85%以上病人產(chǎn)生抗“O”抗體，病愈后可持續(xù)數(shù)月甚至數(shù)年，因此可作為新近鏈球菌感染。除此之外風(fēng)濕熱患者該抗體滴度較高，因此測定其含量可作輔助診斷。目前,血清抗鏈球菌溶血素O的測定已廣泛應(yīng)用于風(fēng)濕病、急性腎炎等與鏈球菌感染有關(guān)疾病的診斷。

在對病人檢測是否患有風(fēng)濕病的時候，常檢測的是病人血清中ASO的含量。正常人的ASO值常在500 U以下，但當(dāng)患有風(fēng)濕病的時候，ASO的值明顯升高。因此測定ASO的含量對判定病人是否患有風(fēng)濕病是一個重要的指標(biāo)[6]。因而制備出高純度的檢測抗原SLO對制備ASO檢測試劑盒是有非常有研究意義的。

2 材料與方法

2.1材料

E.coil DH5α菌株、E.coli BL21-DE3菌株來自實驗室保存，質(zhì)粒pET-32a-tev來自實驗室保存,slo基因模板購買自武漢華美生物技術(shù)公司，Bam H I和Xho I酶購買自Fermentas，T4DNA聚合酶購買自TaKaRa,DNA純化回收試劑盒購買自TIANGEN，質(zhì)粒小抽提取試劑盒購買自道普生物科技有限公司。

2.2方法

2.2.1 PCR獲取目的基因

以購買自武漢華美公司的人源SLO基因作為模板，設(shè)計引物，上游引物序列為GAATTC-CTTGCTCCTAAAGAAATGCC,下游引物序列為CTCGAG-TCACTTATAAGTAATCGAACC（傾斜字體表示BamHI與XhoI的酶切位點），以人源SLO基因作為模板進行PCR，94℃30s，52℃30s，72℃2min，30個循環(huán)。

2.2.2載體的構(gòu)建

用限制性內(nèi)切酶BamHI與XhoI分別酶切載體pET-32a-tev以及PCR產(chǎn)物，37℃酶切3h，將酶切后的質(zhì)粒與PCR產(chǎn)物分別進行膠回收。將回收后的載體與PCR產(chǎn)物按1:3比例混合[7]，室溫放置10min,轉(zhuǎn)化DH5α，涂含有氨芐青霉素的平板，挑取單克隆提質(zhì)粒，送公司（華大基因）測序。

2.2.3重組蛋白的表達與純化[13]

將構(gòu)建好的，測序正確的重組載體轉(zhuǎn)化BL21-DE3，涂含有氨芐青霉素的平板，隨后挑取單克隆接種于含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，于37℃,220rpm培養(yǎng)至OD600值為1.0左右時，加入IPTG (異丙基-β-D-硫代半乳糖苷，終濃度0.5mmol/L)，18℃誘導(dǎo)過夜，8000rpm離心15min收菌。

將收集的菌體用緩沖液A（20mM Tris-HCl,pH8.0+100 mM Na?Cl+10mM咪唑）重懸，用高壓均質(zhì)機（AVESTIN,）15000psi破四遍，4℃條件下20000rpm離心30min。離心后上清與沉淀經(jīng)SDSPAGE檢測，蛋白以可溶形式存在。收集上清，過膜（0.22μm），表達載體pET-32a-tev，帶有組氨酸標(biāo)簽，表達的目的蛋白前端含有TEV的酶切位點。過膜后上清，用蛋白純化儀（AKTA explorer100, GE Healthcare）過親和層析柱（HisTrap HP 5ml,GE Healthcare），用緩沖液B（20mM Tris-HCl+pH8.0+100mM NaCl+500mM咪唑）梯度洗脫。采用SDS-PAGE以及Western-blot對純化蛋白進行檢測。

2.2.4 TEV酶切去除標(biāo)簽

用TEV酶切割重組蛋白His-tev-SLO使標(biāo)簽蛋白His與目的蛋白SLO分開。將上述純化好的SLO重組蛋白用0.02 mol/L PB，pH 8.0磷酸鹽緩沖液透析以去除以前純化的蛋白中的咪唑和高濃度氯化鈉。按1 mg TEV酶切割100 mg目的蛋白的比例加入TEV酶，4℃冰箱酶切過夜。SDS-PAGE以及Western-blot檢測標(biāo)簽去除。

3 結(jié)果分析

3.1目的基因PCR擴增及重組載體鑒定結(jié)果

通過PCR擴增獲得目的基因片段。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果顯示slo基因片段為1700 bp左右，與理論DNA表達片段大小一致（圖1a）。將擴增得到的slo基因片段pET-32a-tev質(zhì)粒分別經(jīng)Bam HⅠ和XhoⅠ雙酶切，連接后得到的重組質(zhì)粒再次雙酶切鑒定，結(jié)果顯示在1700 bp處存在特異性片段（圖1b）,構(gòu)建好的質(zhì)粒測序結(jié)果與NCBI登陸序列一致。

3.2蛋白純化結(jié)果

用蛋白純化儀過親和層析柱，高濃度咪唑梯度洗脫，在咪唑濃度為100mM-200mM之間時出峰，12%SDS-PAGE電泳驗證，可以獲得純度較高的重組SLO蛋白（見圖3），在70KD處有明顯的單一目的條帶，經(jīng)親和層析純化后，

圖1 PCR及雙酶切鑒定結(jié)果Fig.1 The Results of PCR and double restriction endonuclease M為DNA marker

每升菌液可以獲得大約30mg的重組SLO蛋白，將純化后的重組蛋白透析后，用TEV酶切，再次經(jīng)過親和層析出去His標(biāo)簽，得到純度較高的重組蛋白（圖2）。

圖2 His-tev-SLO純化Fig.2 Purified of His-tev-SLO

M：Protein maker；

1：His-tev-SLO陰性對照（未加IPTG誘導(dǎo)）；2：His-tev-SLO上清；3：His-tev-SLO純化；4：His-tev-SLO融合蛋白酶切；5：純化后的SLO；

3.3 Western blotting驗證

純化后SLO蛋白經(jīng)12%SDS-PAGE分析后進行蛋白印跡鑒定，可見在相對分子質(zhì)量約為55 kDa處出現(xiàn)特異性雜交帶，表明為SLO蛋白（圖3）。

圖3 SLO免疫印記Fig.3 Western blottingof SLO預(yù)染Marker 1:對照2：實驗

4.討論

本文通過對SLO原核表達載體的構(gòu)建、表達、純化的研究表明：PCR擴增出的slo基因片段(1700 bp)與理論大小一致。測序結(jié)果證明pET-32a-tev-slo重組表達質(zhì)粒無缺失和突變。SDS-PAGE和Western blot分析經(jīng)TEV酶酶切后的His-tev-SLO后純化的SLO的相對分子質(zhì)量為55 kDa，與NCBI數(shù)據(jù)庫中的結(jié)果相符。Histev-SLO重組融合蛋白經(jīng)過酶切去標(biāo)簽得到了目的蛋白SLO。

[1]陳希,索占偉,許劍琴等.細菌溶血素的分類及代表性溶血素研究進展[J].中國農(nóng)學(xué)通報,2008,24(8):16-22.

[2]Calandra GB,et al:Cellular streptolysin S-related hemolysins of group A Streptococcus C203S[J].Infect Immun,1975,12(4):750-753

[3]Alouf JE:Streptococcal toxins(streptolysin O,streptolysin S, erythrogenic toxin)[J].Pharmacol Ther,1980,11(3):667-717

[4]Gonzalaz M R,Bischofberger M,Pernot L,et al.Bacterial pore?forming toxins:the whole story?[J].Cell Mol life Sci,2008,65(3): 493-507

[5]Thelestam M,et al:Clostridium difficile toxin B induces apop?tosis in intestinal cultured cells[J].Infect Immun,1980,29(3):863-872

[6]鐘蘭,蔡玉玲.免疫透射比濁法對ASO及RF試劑的應(yīng)用性能評價[J].海南醫(yī)學(xué),2010,21(22):55-56.

[7]Feng Na,Hou Xiaoqiang.Prokaryotic Expression and Purifica?tion of Mouse MacrophageMigration Inhibitory Factor Gene[J]. Chin JBiologicals,2009,22(2):132-135.