薤白多糖抑瘤及神經營養(yǎng)活性研究

張占軍，王富花，曾曉雄

（1.揚州市職業(yè)大學生物與化工工程學院，江蘇揚州225009；2.南京農業(yè)大學食品科技學院，江蘇南京210095；3.揚州工業(yè)職業(yè)技術學院，江蘇揚州225127）

薤白多糖抑瘤及神經營養(yǎng)活性研究

張占軍1，2，王富花3，曾曉雄2

（1.揚州市職業(yè)大學生物與化工工程學院，江蘇揚州225009；2.南京農業(yè)大學食品科技學院，江蘇南京210095；3.揚州工業(yè)職業(yè)技術學院，江蘇揚州225127）

采用MTT法對薤白多糖純化組分（AMP40-1、AMP40-2）在體外抑制人肺癌細胞A549和人胃癌細胞BGC-823的增殖作用進行了研究。結果顯示，AMP40-2對人肺癌細胞A549的生長具有一定的抑制作用。對人胃癌細胞BGC-823的增殖實驗結果表明，薤白多糖AMP40-1、AMP40-2均能不同程度的抑制BGC-823細胞的增殖，且抑制作用與多糖之間存在不同程度的正相關量效關系和時效關系。通過大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞PC12培養(yǎng)體系，對薤白多糖純化組分（AMP40-1、AMP40-2）進行了神經營養(yǎng)活性研究。結果表明，薤白多糖AMP40-2對大鼠嗜鉻細胞瘤PC12細胞具有一定的促分化作用。

薤白多糖；癌細胞；增殖；神經營養(yǎng)活性

多糖是由醛糖或酮糖通過糖苷鍵連接而成的多聚物，廣泛分布于自然界中，是一類重要的活性物質。我國對多糖研究起步較晚，但隨著近年來生物學、化學等學科的飛速發(fā)展，我國對多糖及其復合物的研究越來越深入。多糖的生物活性受單糖組成、分子量、結構及蛋白質、糖醛酸及硫酸基的含量等方面的影響較大[1-3]，使得多糖的活性呈多樣化。有關多糖抗腫瘤活性的報道較多，普遍認為以（1→3）-β-D-葡聚糖和以（1→4）-β-D-葡聚糖占優(yōu)勢的多糖具有明顯的抗腫瘤活性[4]；神經營養(yǎng)因子因其對神經系統(tǒng)具有重要的生物學調節(jié)作用，而有望用于治療神經系統(tǒng)疾病，已報道的神經營養(yǎng)因子大多為蛋白質，具有神經營養(yǎng)活性的多糖報道較少，已報道的具有神經營養(yǎng)活性的多糖如刺梨多糖[5]和土黨參多糖[6]等。

蔥屬植物（Allium）屬百合科多年生草本植物，具有獨特的蔥蒜味。全世界己發(fā)現(xiàn)蔥屬植物700多種，我國蔥屬植物資源豐富，約有110多種，具有適應性強，生存環(huán)境廣的特點。薤白為蔥屬多年生草本植物，多食用，其干燥鱗莖也可入藥。截至目前，國內外有關薤白的研究多集中于小分子物質，其藥理活性主要有抑制血小板聚集，抗抑郁[7]，抗菌，抗癌，解痙平喘[8]，鎮(zhèn)痛和耐缺氧以及降血糖、降血脂[9]等。而對薤白多糖藥理活性方面的研究較少。為了解薤白多糖的生理活性，正確評價薤白中的功效成分，本研究對薤白多糖抑制癌細胞增殖以及神經營養(yǎng)活性進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

薤白（野白頭）購于安徽慧隆中藥飲片有限公司。

薤白多糖40%醇沉組分（AMP40-1、AMP40-2）按照文獻[10]所述的分離純化方法進行制備。

1.2 菌種及細胞株

人胃癌BGC-823細胞株，人肺癌A549細胞株，大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤PC12細胞株均由南京農業(yè)大學食品科技學院細胞實驗室提供。

1.3 主要儀器及試劑

3111型Thermo Scientific Forma CO2培養(yǎng)箱：美國Thermo公司；96孔細胞培養(yǎng)板：美國Corning公司；Synergy-2型多功能酶標儀：美國 BioTek公司；NikonTS-100F倒置相差顯微鏡：日本尼康公司；GRP-9080型隔水式恒溫培養(yǎng)箱：上海森信實驗儀器有限公司；SW-CJ-IBU型超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；Series II 3110型細胞培養(yǎng)箱：美國Thermo Scientific公司；DMEM培養(yǎng)基、新生小牛血清、丙酮酸鈉溶液、HEPES試劑購自Gibco公司；噻唑藍（MTT）、0.25%EDTA-胰酶、神經生長因子（NGF）、青霉素-鏈霉素貯存溶液為Sigma產品。二甲基亞砜（DMSO）、營養(yǎng)瓊脂及牛肉膏、膽鹽、磷酸氫二鉀、蛋白胨、氯化鈉均為國產分析純試劑。

1.4 方法

1.4.1 薤白多糖的體外抑制腫瘤細胞增殖活性研究

薤白多糖對人肺癌細胞A549及人胃癌細胞BGC-823增殖的抑制作用按照Mosman[11]和Sheng等[12]報道的方法稍有修改。

1.4.1.1 人肺癌細胞A549及人胃癌細胞BGC-823的培養(yǎng)

A549和BGC-823細胞株凍存管解凍后，將凍存液無菌轉移至含有5mLDMEM完全培養(yǎng)基中離心10min，傾去上清部分，沉淀部分加10mLDMEM完全培養(yǎng)基制取細胞懸浮液，并轉移至細胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待貼壁生長良好后，水平輕微搖晃并吸干培養(yǎng)液，加入適量胰酶（以液面蓋住細胞為宜），37℃條件下放置2min～3min，顯微鏡觀察使細胞消化適度，隨即吸干消化液，加入適量完全DMEM培養(yǎng)基，用吸管反復吹打成單細胞懸液。將以上細胞按需要稀釋后接種于新的細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，每2天～每3天左右傳代一次以保持細胞處在對數(shù)生長期。

1.4.1.2 細胞接種

取處于對數(shù)生長期的A549和BGC-823細胞按上述方法酶解、細胞計數(shù)法調整細胞數(shù)約為1×105個/m L（A549細胞為5×104個/mL），然后接種到96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔100μL。以純DMEM完全培養(yǎng)基作為調零孔，于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱預培養(yǎng)24h。

1.4.1.3 薤白多糖樣品對A549和BGC-823細胞增殖的抑制作用

以薤白多糖純化組分（AMP40-1、AMP40-2、AMP60-1和AMP80-1）為實驗樣品，對分別接種A549和BGC-823的細胞培養(yǎng)板預培養(yǎng)24 h后進行加樣處理，用排槍每孔吸去50μL培養(yǎng)液。實驗設正常對照組和不同濃度（25、50、100、200、400μg/mL）的樣品組。正常對照組每孔加50μLDMEM培養(yǎng)液；樣品組分別加入終濃度為25、50、100、200、400μg/mL的薤白多糖純化組分溶液（用新鮮DMEM完全培養(yǎng)基溶解）各50μL/孔。人肺癌細胞A549培養(yǎng)72 h，人胃癌細胞BGC-823分別培養(yǎng)24、48、72 h后，加入10μL 5mg/mLMTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，小心移去培養(yǎng)液，每孔加入100μL DMSO溶液溶解藍紫色結晶。水平晃動搖勻后，用酶標儀測定550 nm波長下的各孔的光吸收值（Abs），檢測不同多糖樣品對腫瘤細胞的抑制情況，按下式計算多糖對腫瘤細胞的抑制率：

1.4.2 薤白多糖神經營養(yǎng)活性研究

薤白多糖對PC-12細胞的神經營養(yǎng)活性按照Buchet[13]和Wu[14]等報道的方法略作修改。

1.4.2.1 PC12細胞的培養(yǎng)

PC12細胞采用高糖85%DMEM加12%胎牛血清、3%的馬血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的培養(yǎng)液，置于37℃的5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天～每3天換液一次，待單層細胞生長到約80%匯合后進行傳代培養(yǎng)。

1.4.2.2 細胞接種

將對數(shù)生長期的PC12細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板中（培養(yǎng)液為3%的馬血清，12%胎牛血清，85% DMEM），調整每孔細胞數(shù)約為1×104，在37℃，5%CO2條件下預培養(yǎng)16 h。

1.4.2.3 薤白多糖對大鼠嗜鉻細胞瘤PC12細胞的分化作用

以薤白多糖純化組分（AMP40-1、AMP40-2）為實驗樣品，對接種PC12的細胞培養(yǎng)板進行加樣處理。吸去原培養(yǎng)液，分別加入終濃度為20μg/mL的薤白多糖樣品（AMP40-1、AMP40-2），終體積為200μL。同時實驗設對照組和NGF對照組（NGF終濃度為100 ng/mL）。在37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天～每4天換液1次，連續(xù)培養(yǎng)14 d。定期用倒置顯微鏡觀察細胞生長情況，其中神經突起長度超過胞體直徑2倍以上的細胞被記為分化細胞。

2 結果與分析

2.1 薤白多糖的體外抑制腫瘤細胞增殖活性

2.1.1 薤白多糖作用48 h對人肺癌細胞A549生長的抑制作用

薤白多糖40%醇沉純化組分AMP40-1、AMP40-2對人肺癌細胞A549生長的抑制作用如圖1所示。

圖1 薤白多糖作用48小時對人肺癌細胞A 549生長的抑制作用Fig.1 Effectof AMPon grow th inhibition of human lung carcinoma A549 cells for 48 hours

從圖1可以看出，AMP40-1未發(fā)現(xiàn)對人肺癌細胞A549的生長有抑制作用，而AMP40-2對人肺癌細胞A549的生長具有一定的抑制作用，且在實驗范圍內其抑制作用與濃度呈明顯的濃度依賴效應。

根據(jù)文獻報道，多糖對人肺癌細胞A549生長的抑制率普遍較低，如Sheng等[12]報道的蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）多糖CPPSIa在濃度600μg/mL作用48 h后對A549的抑制率也只有37.6%；Ye等[15]報道的馬尾藻多糖組分SPP-3-1與SPP-3-2的抑制率在濃度為 1.0 mg/mL時抑制率分別為64.81%和66.99%。相比其它多糖，薤白多糖AMP40-2在濃度400μg/mL作用48 h后抑制率能達到27.52%，表明其對人肺癌細胞A549具有較好的抑制活性。與AMP40-1相比，AMP40-2對人肺癌細胞A549的抑制作用存在明顯的差異，這可能是由于在分子量、單糖組成、糖連接方式及糖醛酸含量等方面的差異造成的。

2.1.2 薤白多糖對人肺癌細胞BGC-823生長的抑制作用

薤白多糖40%醇沉純化組分AMP40-1、AMP40-2對人胃癌細胞BGC-823作用24小時后增殖的影響如圖2所示。

圖2 薤白多糖作用24小時對人胃癌細胞BGC-823生長的抑制作用Fig.2 Effect of AM P on grow th inhibition of human gastric carcinoma BGC-823 cells for 24 hours

從圖2可以看出，純化組分AMP40-1和AMP40-2對人胃癌細胞BGC-823的生長具有一定的抑制作用，其中AMP40-2的抑制作用與濃度在一定范圍內呈明顯的正相關量效關系。AMP40-2對人胃癌細胞BGC-823的抑制作用在濃度400μg/mL作用24小時后抑制率達到29.88%，顯著要高于AMP40-1的7.38%。

薤白多糖 40%醇沉純化組分 AMP40-1和AMP40-2對人胃癌細胞BGC-823作用48h后的抑制作用如圖3所示。

圖3 薤白多糖作用48小時對人胃癌細胞BGC-823生長的抑制作用Fig.3 Effectof AMPon grow th inhibition of human gastric carcinoma BGC-823 cells for 48 hours

從圖3可以看出，純化組分AMP40-1和AMP40-2對人胃癌細胞BGC-823的生長均起到一定的抑制作用，且組分AMP40-1、AMP40-2的抑制作用與濃度在實驗范圍內呈明顯的正相關量效關系。與作用24 h一樣，AMP40-2對人胃癌細胞BGC-823的抑制作用明顯強于其它組分，在濃度400μg/mL時，它們對BGC-823細胞的抑制率分別為72.01%和48.46%。

薤白多糖純化組分AMP40-1、AMP40-2對人胃癌細胞BGC-823作用72 h后的抑制作用如圖4所示。

圖4 薤白多糖作用72小時對人胃癌細胞BGC-823生長的抑制作用Fig.4 Effect of AM P on grow th inhibition of human gastric carcinoma BGC-823 cells for 72 hours

從圖4可以看出，40%醇沉純化組分AMP40-1和AMP40-2對人胃癌細胞BGC-823的生長均具有一定的抑制作用，且AMP40-1和AMP40-2的抑制作用與濃度在實驗范圍內呈明顯的正相關量效關系。與作用24、48 h一樣，AMP40-2對人胃癌細胞BGC-823的抑制作用明顯強于AMP40-1，在濃度400μg/m L時，它們對BGC-823細胞的抑制率分別達到85.95%和52.63%。此結果也進一步表明薤白多糖對人胃癌細胞BGC-823的抑制作用的強弱與其多糖分子量的大小、糖醛酸含量以及單糖組成等因素存在明顯的對應關系。

2.2 薤白多糖對大鼠嗜鉻細胞瘤PC12細胞的分化作用

通過大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞PC12培養(yǎng)體系，以NGF為陽性對照，分別加入薤白多糖后連續(xù)培養(yǎng)14 d后在相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，并進行顯微照相，實驗結果如圖5所示。

圖5 薤白多糖對大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤PC12細胞分化的影響Fig.5 Effect of AM P on differen tiation of ratadrenal pheochrom ocytoma PC12 cells

PC12細胞模型常被用于研究神經元的發(fā)育、分化和功能。PC12細胞表面分布有豐富的NGF受體，該細胞受到NGF樣活性物質刺激后會停止細胞分裂，長出神經突起，成為交感神經細胞元樣的細胞[5]。從圖5可以看出，AMP40-1和空白對照組細胞呈球形，均未長出突起，AMP40-2部分長出神經樣纖維，NGF陽性對照組大量長出神經樣纖維。說明薤白多糖AMP40-2對大鼠嗜鉻細胞瘤PC12細胞具有一定的促分化作用，即AMP40-2具有神經營養(yǎng)活性。

3 結論與展望

腫瘤是當今世界直接危及人類生命的一種最常見、最嚴重的疾病，因而如何有效地預防和治療腫瘤已成為醫(yī)學領域研究的一個熱點[16]。19世紀60年代Chihara首次報道了有關大型真菌多糖的抗癌活性，此后，研究人員陸續(xù)分離得到了各種結構的具有較強抗腫瘤活性的多糖。不同于傳統(tǒng)的抗癌藥物，這些物質是通過激活機體各種免疫反應來產生抗腫瘤作用，因此對機體并不會造成傷害[17]。本研究發(fā)現(xiàn)薤白多糖對人胃癌細胞BGC-823存在較強的抑制作用，由于AMP40-1和AMP40-2在分子量大小、糖醛酸含量及單糖組成等方面存在著較大區(qū)別，結果也進一步表明了多糖抗癌活性的強弱與上述因素存在明顯的對應關系。另一方面，根據(jù)文獻報道，目前神經營養(yǎng)因子大多為蛋白質類物質，有關多糖的神經營養(yǎng)活性報道的并不多，盡管相對于NGF，薤白多糖AMP40-2的神經營養(yǎng)活性還較弱，但通過多糖神經營養(yǎng)活性的研究，對于豐富神經營養(yǎng)因子類物質的認識以及開發(fā)多糖的新用途具有重要意義。

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The An titum or Activity and Neurotrophic Activity of Polysaccharides from Allium macrostemon Bunge

ZHANGZhan-jun1，2，WANGFu-hua3，ZENGXiao-xiong2
（1.College of Biologicaland Chemical Engineering，Yangzhou VocationalUniversity，Yangzhou 225009，Jiangsu，China；2.Collegeof Food Science and Technology，Nanjing AgriculturalUniversity，Nanjing 210095，Jiangsu，China；3.Yangzhou Polytechnology Institute，Yangzhou 225127，Jiangsu，China）

MTTassaywasused to investigate the anti-proliferation activitiesagainsthuman gastric cancer cells（BGC-823）and human lungadenocarcinoma epithelialcells（A549）in vitroof AMP40-1 and AMP40-2.The results showed that AMP40-2 inhibited proliferation of A549 in a dose-dependentmanner.For human gastric carcinoma cell BGC-823，AMP40-1 and AMP40-2 significantly inhibited proliferation in dose-dependentand time-dependent manner.The neurotrophic activity of polysaccharides from A.macrostemon Bunge were investingated by PC12 cell assay.The screening results showed that AMP40-2 induced the differentiation of PC12 celland hasobviousneurotrophic activity.

polysaccharide from Allium macrostemon bunge；cancer cells；proliferation；neurotrophic activity

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.05.026

2013-12-09

江蘇省基礎研究計劃（自然科學基金）項目（BK20141269）；江蘇省高校“青藍工程”（蘇教師[2012]39號）

張占軍（1977—），男（漢），副教授，博士，研究方向：食品生物技術。