HPLC法測定濃縮果汁多菌靈含量的不確定度評定

劉勝男，鞏衛(wèi)東，張國慶，衛(wèi)星，帥瑾

（三門峽出入境檢驗檢疫局，河南三門峽 472000）

HPLC法測定濃縮果汁多菌靈含量的不確定度評定

劉勝男，鞏衛(wèi)東，張國慶，衛(wèi)星，帥瑾

（三門峽出入境檢驗檢疫局，河南三門峽 472000）

根據(jù)方法SN/T 1753-2006《進出口濃縮果汁中噻菌靈、多菌靈殘留量檢測方法高效液相色譜法》，建立高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）測定濃縮果汁中多菌靈含量不確定度的數(shù)學模型，通過對整個測定過程中各種不確定度因素的研究，分析該測定方法不確定度的來源并對其進行評定，確定不確定度分量，合成不確定度。結(jié)果表明：當多菌靈含量為0.045mg/kg時，其擴展不確定度為0.004 4mg/kg（k=2）。其中標準溶液的配制、樣品處理操作過程對測量不確定度影響較大。通過對測量不確定度的評定，為有效地控制濃縮果汁中多菌靈含量的檢測質(zhì)量提供可靠的理論依據(jù)。

不確定度；多菌靈；高效液相色譜（HPLC）；濃縮果汁

測量不確定度指表征合理地賦予被測量值的分散性，與測量結(jié)果相聯(lián)系的參數(shù)[1]。近年來，隨著科學技術(shù)的發(fā)展，為了提高樣品檢測的準確性和檢測結(jié)果的可靠性，要求報告測量結(jié)果時，必須用不確定度來確定測量結(jié)果的可信程度[2]。國際標準ISO/IEC 17025-2005《檢測和校準實驗室能力認可準則》中將不確定度評估作為測試和校準方法及方法驗證的一個重要技術(shù)要求，并規(guī)定實驗室應(yīng)建立相應(yīng)的不確定度評估程序，以實現(xiàn)檢測結(jié)果的國際互認[3]。多菌靈是一種內(nèi)吸性殺菌劑，可被植物吸收并經(jīng)傳導(dǎo)轉(zhuǎn)移到其他部位，干擾病菌細胞的有絲分裂，抑制其生長，主要用于防止蔬菜、水果、糧食等多種真菌病害，還可用于水果保鮮。多菌靈化學性質(zhì)穩(wěn)定，在自然環(huán)境中降解較慢，且具有一定毒性，能持久保留在果蔬中，若使用不當，會在果蔬及由果蔬制成的果蔬汁中殘留[4]。我國及國際上各國對果汁中多菌靈的殘留量都十分重視，因此，對果汁中多菌靈的監(jiān)測已成為一項重要的常規(guī)檢測項目。本文依據(jù)JJF 1059.1-2012《測量不確定度評定與表示》[1]和CNAS-CL 06《化學分析中不確定度的評估指南》[2]規(guī)定的基本方法和程序，參照SN/T 1753-2006《進出口濃縮果汁中噻菌靈、多菌靈殘留量檢測方法高效液相色譜法》，對濃縮果汁中多菌靈殘留測定引起的不確定度進行分析評定，找出影響測定結(jié)果的各主要分量，在實際操作中可用于指導(dǎo)分析人員進行重點控制，從而提高測定結(jié)果的準確性和可靠性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

濃縮蘋果汁（三門峽緣份果業(yè)有限公司）；多菌靈農(nóng)藥標準品 Dr.Ehrenstorfer公司；甲醇（色譜純）迪馬公司；乙腈（色譜純）迪馬公司；磷酸鹽緩沖液（0.02mol/L，pH6.8，1.38 g磷酸二氫鈉和1.41 g磷酸氫二鈉溶于900mL水中，用稀氫氧化鈉或稀磷酸調(diào)pH=6.8，定容

式中：X為試樣中多菌靈的含量，（mg/kg）；A為樣液中多菌靈的峰面積；C為標準溶液中多菌靈的濃度，（μg/mL）；V3為試樣凈化液最后定容體積，mL；m為稱取試樣的質(zhì)量，g；AS為標準溶液中多菌靈的峰面積；V2為凈化用提取液體積，mL；V1為試樣提取液總體積，至1 000m L）；混合固相萃取小柱（PLEXA PCX固相萃取柱，3CC，60mg）：安捷倫公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1260高效液相色譜儀（配有二極管陣列檢測器）：美國安捷倫公司；PL403-IC電子天平：梅特勒公司；STARTER 3C酸度計：奧豪斯公司。

1.3 方法

1.3.1 分析步驟

稱取2.5 g濃縮果汁，加水稀釋，振蕩混勻并定容至25mL。將該稀釋液轉(zhuǎn)移到150mL錐形瓶中，用2mol/L氫氧化鈉調(diào)pH=10后，倒入50mL聚丙烯塑料離心管中以8 000 r/min離心10min，取上清液待凈化。

準確吸取10.0mL離心上清液上混合固相萃取小柱，依次用2mL 0.15mol/L氨水、2mL氨水（0.15mol/L）―甲醇溶液、2mL 0.1mol/L鹽酸、3mL甲醇淋洗柱子，棄去淋洗流出液，整個淋洗過程的流速控制在3mL/min以內(nèi)。最后用3mL氨水（0.3mol/L）―甲醇溶液洗脫柱子，收集洗脫液，于45℃水浴用微弱的氮氣吹干。用1.0m L流動相溶解殘渣，經(jīng)0.45μm濾膜過濾后，供液相色譜分析。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：AgilentZORBAXSB-C18色譜柱（150mm× 4.6mm，5μm）；流動相：磷酸鹽緩沖液+乙腈（80+20），使用前經(jīng)0.45μm濾膜過濾；流速1.0mL/min；檢測波長288 nm；柱溫25℃；進樣量20μL。

1.4 數(shù)學模型

濃縮果汁中多菌靈殘留量的計算公式見式（1）：mL；frec為回收率校正因子。

2 測量不確定度的來源

測量方法的主要步驟為稱量取樣，待測樣品的提取、定容、標準系列的配制、儀器分析。由式（1）可知，實驗的測量不確定度主要來源有以下幾個方面：

1）樣品稱量引入的不確定度urel（m）；

2）試樣提取液總體積引入的不確定度urel（V1）；

3）凈化用提取液體積引入的不確定度urel（V2）；

4）試樣凈化液最后定容體積引入的不確定度urel（V3）；

5）標準溶液中多菌靈的濃度引入的不確定度urel（C）；

6）標準工作溶液峰面積測量引入的不確定度urel（AS）；

7）樣品中多菌靈峰面積測量引入的不確定度urel（A）；

8）回收率引入的不確定度urel（frec）；

9）測量重復(fù)性產(chǎn)生的A類不確定度urel（w）。

3 不確定度的評定

3.1 樣品稱量引入的不確定度urel（m）

稱量的不確定度來源為：稱量的重復(fù)性和天平校準產(chǎn)生的不確定度分量。天平校準有兩個潛在不確定度來源，即天平的靈敏度以及線性，因稱量是用同一天平，在很窄的范圍內(nèi)進行，靈敏度可以忽略[5]。

3.1.1 稱量重復(fù)性引入的不確定度u1（m）

由天平檢定證書得到天平重復(fù)性誤差為0.001 g，服從矩形分布，k=，轉(zhuǎn)化為標準不確定度為u1=0.577×10-3（g）。

3.1.2 天平校準引入的不確定度u2（m）

由天平說明書得到電子天平的線性誤差為±0.002 g，服從矩形分布，k=，轉(zhuǎn)化為標準不確定度u1（m）==0.115×10-2（g）。

樣品稱樣量為2.500 g，綜上得到樣品稱量引入的相對標準不確定度為urel（m）== 0.515×10-3。

3.2 試樣提取液總體積引入的不確定度urel（V1）

3.2.1 容量瓶校準引入的不確定度u1（V1）

使用檢定合格的25mLA級容量瓶定容，按照《常用玻璃量具檢定規(guī)程JJG 196-2006》，其最大容量允差為±0.03 m L，按矩形分布，k=，則標準不確定度u1（V1）==0.017 3（mL）。

3.2.2 溫度變化引入的不確定度u2（V1）

容量瓶是在20℃溫度下校準為25.00mL，假設(shè)溫差為±3℃，水的體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4/℃，產(chǎn)生的體積變化為：±（25×3×2.1×10-4）=0.015 8mL，按矩形分布，k=，則標準不確定度u2（V1）== 0.009 12（mL）。

綜上得到體積V1的合成標準不確定度u（V1）==0.019 6（mL），轉(zhuǎn)化為相對標準不確定度為urel（V1）==0.784×10-3。

3.3 凈化用提取液體積引入的不確定度urel（V2）

3.3.1 分度吸量管校準引入的不確定度u1（V2）

使用檢定合格的10mL分度吸量管，按照《常用玻璃量具檢定規(guī)程JJG 196-2006》，其最大容量允差為±0.05mL，按矩形分布，k=，則標準不確定度u

1（V2）==0.028 9（mL）。

3.3.2 溫度變化引入的不確定度u2（V2）

量器校準是在20℃溫度下進行，假設(shè)溫差為±3℃，水的體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4/℃，產(chǎn)生的體積變化為：±（10×3×2.1×10-4）=0.006 30mL，按矩形分布，k=，則標準不確定度u2（V2）==0.003 64（mL）。

綜上得到體積V2的合成標準不確定度u（V2）==0.029 1（mL），轉(zhuǎn)化為相對標準不確定度為urel（V2）==0.291×10-2。

3.4 試樣凈化液最后定容體積引入的不確定度urel（V3）

3.4.1 移液器校準引入的不確定度u1（V3）

使用檢定合格的1.0mL移液器，按照《移液器檢定規(guī)程JJG 646-2006》，其容量允差為±1.0%，按矩形分布，k=，則標準不確定度u1（V3）== 0.005 77（mL）。

3.4.2 溫度變化引入的不確定度u2（V3）

量器校準是在20℃溫度下進行，假設(shè)溫差為±3℃，水的體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4/℃，產(chǎn)生的體積變化為：±（1.0×3×2.1×10-4）=0.000 630mL，按矩形分布，k=，則標準不確定度u2（V3）==0.000 364（m L）。

綜上得到體積V2的合成標準不確定度u（V3）==0.005 78（mL），轉(zhuǎn)化為相對標準不確定度為urel（V3）==0.578×10-2。

3.5 標準溶液中多菌靈濃度引入的不確定度urel（C）

3.5.1 有證標準物質(zhì)引入的不確定度u1rel（C）

多菌靈標準物質(zhì)由Dr.Ehrenstorfer公司提供，其擴展不確定度為±0.5%，包含因子k=2，純度為99.5%，其相對標準不確定度u1rel（C）=）/99.5%= 0.251×10-2。

3.5.2 標準物質(zhì)稱量引入的不確定度u2rel（C）

3.5.2.1 稱量重復(fù)性引入的不確定度u1（C）

由天平檢定證書得到天平重復(fù)性誤差為0.1mg，服從矩形分布，k=，轉(zhuǎn)化為標準不確定度u1（C）==0.577×10-4（g）。

3.5.2.2 天平校準引入的不確定度u2（C）

由天平說明書得到電子天平線性誤差為±0.2mg，服從矩形分布，k=，轉(zhuǎn)化為標準不確定度u2（C）==0.115×10-3（g）。

準確稱取多菌靈標準物質(zhì)0.010 0 g，綜上得到標準物質(zhì)稱量引入的相對標準不確定度u2rel（C）==0.012 9。

3.5.3 標準溶液配制過程中量器校準引入的不確定度u3rel（C）

標準儲備溶液配制過程：將稱量好的0.010 0 g多菌靈標準物質(zhì)用甲醇溶解定容到100mL，配制成濃度為100μg/m L的標準儲備溶液。用1m L的可調(diào)移液器吸取1mL 100μg/mL的標準儲備溶液，用甲醇溶解定容到100mL，配制成濃度為1μg/mL的標準儲備溶液。

標準工作溶液配制過程：分別準確量取0.2、0.4、0.8、1.6、3.2mL濃度為1μg/mL的標準儲備溶液，用流動相分別定容到10mL，配制成濃度分別為0.02、0.04、0.08、0.16、0.32μg/m L的標準工作溶液。

標準溶液制備過程中使用檢定合格的玻璃量器10、100mL容量瓶，5、2、1mL刻度移液管，10μL～1 000μL移液器，按照《常用玻璃量具檢定規(guī)程JJG 196-2006》和《移液器檢定規(guī)程JJG 646-2006》的要求，均有相應(yīng)的容量允差，按照矩形分布考慮，k=，即標準不確定度=，由此可得到量器校準引入的相對標準不確定度分量見表1。

由表1可得，標準溶液配制過程中量器校準引入的合成相對標準不確定度為：

表1 標準溶液配制過程量器校準引入的不確定度Table 1 Uncer tainty arouse from errors in calibration of volum etric glasswaresused in p reparations of standard solutions

3.5.4 標準溶液配制過程中環(huán)境溫度變化引入的不確定度u4rel（C）

實驗過程中，實驗室的溫度很難保證在20℃，溫度變化引起的液體膨脹明顯大于量器的體積膨脹，因此，只考慮前者即可。已知水的體積膨脹系數(shù)為2.1× 10-4/℃，當配制溶液時室溫在（20±3）℃之間波動時，產(chǎn)生的體積變化計算公式為：±（量取體積×3×2.1× 10-4）mL。按照矩形分布考慮，k=，則標準溶液配制過程中環(huán)境溫度變化產(chǎn)生的不確定度見表2。

由表2可得，標準溶液配制過程中溫度變化引入的合成相對標準不確定度為：

3.5.5 校準曲線擬合引入的不確定度u5rel（C）

多菌靈標準工作溶液配制5個濃度梯度，每個濃度梯度用高效液相色譜測定3次，得到相應(yīng)的峰面積，如表3所示。

用最小二乘法進行擬合，得到直線方程yij=bCi+ a（其中，a=0.043 1，b=92.88），相關(guān)系數(shù)R=0.999 8。式中，yij為第i個標準溶液第j次峰面積；Ci為第i個標準溶液濃度；b為斜率；a為截距。

表2 標準溶液配制過程環(huán)境溫度變化引起的不確定度Tab le2 Uncertainty arouse from effect change in tem peratureon thevolumetric glasswaresduring preparationsof standard solutions

表3 標準溶液測定結(jié)果Table3 Resultsof standard solutions

對樣品處理液進行2次測定，由測得的峰面積通過校準曲線求得兩次測定結(jié)果，分別為0.045 0、0.0470μg/mL，則C0=（0.045 0+0.047 0）/2=0.046 0μg/mL，則標準曲線擬合的標準不確定度為：

式中：C0為由標準曲線計算出樣品中多菌靈的濃度為標準樣品的平均濃度（=0.124μg/mL）；p為樣品溶液測定的次數(shù)，p=2；n為工作曲線測定的點數(shù)，n=15；為第i個標準溶液的濃度，μg/mL；b為擬合曲線的斜率；s（y）為擬合曲線的標準偏差。

擬合曲線的標準偏差

綜上得到標準溶液中多菌靈的濃度引入的相對標準不確定度為：

3.6 標準工作溶液峰面積測量引入的不確定度urel（AS）

3.6.1 峰面積重復(fù)測量引入的不確定度u1（As）

將0.040μg/m L標準溶液重復(fù)進樣6次，得到多菌靈的峰面積分別為4.023、4.028、4.020、4.017、4.027、4.020，其平均值A(chǔ)S=4.022，平均值的測量標準偏差=0.001 78，轉(zhuǎn)化為相對標準不確定度為

3.6.2 儀器校準引入的不確定度u2（As）

由儀器檢定證書得到儀器定量重復(fù)性誤差為1.4%，按照矩形分布考慮，k=，所以相對標準不確定度為：u2rel（AS）==0.008 08

綜上得到標準工作溶液峰面積測量引入的相對標準不確定度為：0.008 09。

3.7 樣品中多菌靈峰面積測量引入的不確定度urel（A）

3.7.1 峰面積重復(fù)測量引入的不確定度u1（A）

將樣品處理液重復(fù)進樣6次，得到多菌靈的峰面積分別為4.233、4.241、4.220、4.230、4.227、4.238，其平均值=4.232，平均值測量的標準偏差=0.003 11，轉(zhuǎn)化為相對標準不確定度為

3.7.2 儀器校準引入的不確定度u2（A）

同3.6.2，得到儀器校準引入的相對標準不確定度為：u2rel（As）=0.008 08。

綜上得到樣品中多菌靈峰面積測量引入的相對標準不確定度為：urel（A）==0.00811。

3.8 回收率引入的不確定度urel（frec）

樣品前處理過程包括提取和凈化等步驟，過程復(fù)雜，樣品處理操作過程中的差異引起的不確定度實驗中以6次回收率的結(jié)果統(tǒng)一評定。在陰性樣品基質(zhì)中添加濃度為0.040mg/kg的多菌靈標準溶液，6次回收率測定結(jié)果為：91.3%、90.6%、94.3%、95.2%、90.0%、93.1%，平均值=92.4%，標準偏差為S（frec）=2.10%，回收率的標準不確定度為u（frec）==0.857%，回收率的相對標準不確定度為urel（frec）==0.009 28。

3.9 測量重復(fù)性產(chǎn)生的A類不確定度urel（w）

對同一樣品進行連續(xù)6次測試，數(shù)據(jù)見表4。

表4 多菌靈含量重復(fù)性測定結(jié)果Table 4 Resultsof carbendazim of repeat determ ination

單次測定標準偏差s（wi）== 0.000 871mg/kg，平均值的標準偏差u（w）== 0.000 356mg/kg，相對標準不確定度urel（w）== 0.007 84。

4 合成相對標準不確定度

5 擴展不確定度

取包含因子k=2，置信水平約為95%，w= 0.045 4mg/kg，擴展不確定度U（X）=k×urel（X）×0.0454= 0.004 38mg/kg。

6 測量不確定度報告

樣品中多菌靈含量的不確定度報告如下：X=（0.045±0.004 4）mg/kg，k=2。

7 結(jié)論

從上述不確定度整個評定過程可以看出，影響最終不確定度結(jié)果的主要是標準溶液的配制、樣品回收率兩個分量，而樣品稱量和定容過程對最終不確定度結(jié)果影響較小。因此，在檢測過程中應(yīng)嚴格控制測量和樣品處理過程，特別應(yīng)強調(diào)檢測過程準確性和前處理操作過程的規(guī)范性，以及標準工作溶液配制的精確性，認真對待每個環(huán)節(jié)確保檢測結(jié)果的準確可靠。

[1]國家質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局.JJF 1059.1-2012測量不確定度評定與表示[S].北京:國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局,2012

[2]中國合格評定國家認可委員會.CNAS-CL06:2011化學分析中不確定度的評估指南[S].北京:中國知識出版社,2011

[3]中國合格評定國家認可委員會.CNAS-CL01:2006檢測和校準實驗室能力認可準則[S].北京:中國知識出版社,2006

[4]楊楠,張琦,權(quán)伍英,等.QuEChERS前處理方法結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)檢測蔬菜中的多菌靈[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志,2011,21 (5):1096-1097

[5]楊媛,石磊,李文生,等.高效液相色譜法測定蘋果中多菌靈殘留量的測量不確定度分析[J].農(nóng)藥學學報,2010,12(3):349-354

Uncertainty Evaluation for the Determ ination Resu lts of Carbendazim in Concentrated Fruit Juice by HPLC

LIU Sheng-nan，GONGWei-dong，ZHANGGuo-qing，WEIXing，SHUAIJin
（Sanmenxia Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau of P.R.China，Sanmenxia472000，Henan，China）

Based on SN/T 1753-2006，amathernaticalmodel of uncertainty evaluation for the determinationresultsof carbendazim in concentrated fruit juice by HPLCwasestablished.The sources of uncertainty for the whole determination procedure were analyzed and the combined uncertainty was then finally obtained by synthesizing the variousmeasurementofuncertainty.The resultshowed the expanded uncertainty of0.004 4mg/ kg（k=2）with 0.045 mg/kg of the content of carbendazim was derived.Themajor sources of uncertainty of measurement included preparationsofstandard solutions，sampleprocessing.Thispaper provided reliable basis to controlanalysisqualityof carbendazim detection in concentrated fruit juice.

uncertainty；carbendazim；High Performance Liquid Chromatography（HPLC）；concentrated fruit juice

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.05.024

2013-12-22

劉勝男（1987—），女（漢），碩士研究生，主要從事進出口食品檢測。