苦瓜多糖含量的苯酚硫酸法檢測研究

張居作，許巧玲，徐君飛，*

（1.民族藥用植物資源研究與利用湖南省重點實驗室，懷化學(xué)院生命科學(xué)系，湖南懷化418008；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，湖南長沙410128）

苦瓜多糖含量的苯酚硫酸法檢測研究

張居作1，2，許巧玲1，徐君飛1，*

（1.民族藥用植物資源研究與利用湖南省重點實驗室，懷化學(xué)院生命科學(xué)系，湖南懷化418008；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，湖南長沙410128）

為了尋找適于測定苦瓜多糖含量的穩(wěn)定方法，本文對苯酚硫酸法測定苦瓜多糖的條件進行了研究。實驗結(jié)果表明，在苯酚硫酸法中，測定條件為1mL 1%苦瓜多糖溶液與0.4m L 6%苯酚、4.5mL濃硫酸60℃顯色10min，493 nm波長處測定吸光度。結(jié)果表明，改進后的苯酚硫酸法是測定苦瓜多糖含量的一種回收率高，穩(wěn)定性好的簡便方法。

苦瓜多糖；苯酚-硫酸法；檢測

苦瓜多糖是苦瓜的主要有效成分[1]，經(jīng)研究表明，苦瓜多糖具有降血糖、抗病毒、抗腫瘤、抗艾滋病、提高免疫力等功效[2]，為了便于苦瓜種植基地和加工企業(yè)控制、檢測苦瓜原料的質(zhì)量，進而控制和確保苦瓜制品的質(zhì)量，有必要建立一套操作簡單、容易實施的苦瓜多糖測定方法。

目前測量多糖含量的方法主要是苯酚—硫酸法[3-4]，但是，苯酚—硫酸法測定多糖含量仍然存在著數(shù)據(jù)波動較大，重復(fù)性差等缺點，為了提高測定方法的準確性和重復(fù)性，本文通過一系列實驗確定了苯酚—硫酸法測定苦瓜多糖的最佳條件，使得改進后的苯酚—硫酸法測定苦瓜多糖含量的數(shù)據(jù)更可靠、更穩(wěn)定。

1 材料與方法

1.1 材料

苦瓜，購自菜市場；D-葡萄糖、苯酚、濃硫酸、無水乙醇等均為國產(chǎn)分析純，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；P05-Y純水儀，國之源有限公司；5804R高速冷凍離心機，Eppendorf；UV-2450紫外可見分光光度計，島津公司；R201D旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠，等。

1.2 方法

1.2.1 原料預(yù)處理

苦瓜切片干燥粉碎→過40目篩→80%乙醇90℃回流提取2次→濾渣60℃烘干。

1.2.2 苦瓜多糖提取

稱取預(yù)處理苦瓜粉→1∶50加入超純水96℃浸提230min→6 000 r/min離心10min取上清→60℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至原濾液體積1/5→加5倍體積85%乙醇→冰箱放置過夜→6 000 r/min離心10min取沉淀→60℃干燥至恒重。

1.2.3 苯酚—硫酸法測定苦瓜多糖含量條件的優(yōu)化

1.2.3.1 最大吸收波長

分別吸取苦瓜粗多糖溶液和60.0μg/mL葡萄糖標準溶液各1mL于具塞比色試管，加水補足至2mL，以蒸餾水為空白，加入1m L 6%苯酚溶液，搖勻后迅速滴加5mL濃硫酸，室溫反應(yīng)30min，采用紫外可見分光光度計在400 nm～600 nm進行波譜掃描，確定最大吸收波長。

1.2.3.2 最適濃硫酸用量

吸取1mL苦瓜粗多糖溶液，加水補足至2mL，加入1m L 6%苯酚溶液，搖勻，分別迅速滴加3.0、3.5、4.0、4.5、5.0mL濃硫酸[5]，室溫放置30min，于最大吸收波長處測定吸光度，選擇濃硫酸的最適用量。

1.2.3.3 最適苯酚用量

吸取1mL苦瓜粗多糖溶液，加水補足至2mL，分別加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0m L 6%苯酚溶液[6]，搖勻，迅速滴加4.5mL濃硫酸，室溫放置30min，測定吸光度，選擇苯酚的最適用量。

1.2.3.4 最適顯色溫度

吸取1mL苦瓜粗多糖溶液，加水補足至2mL，加入0.4mL 6%苯酚溶液，搖勻，迅速滴加4.5mL濃硫酸，搖勻，分別在20、30、40、50、60、70、80、90、100℃下放置30min，測定吸光度，選擇最適顯色溫度。

1.2.3.5 最適顯色時間

吸取1m L苦瓜粗多糖溶液，加水補足至2mL，加入0.4mL 6%苯酚溶液，搖勻，迅速滴加4.5mL濃硫酸，搖勻，60℃放置5、10、15、20、25min，測定吸光度，選擇最適顯色時間。

1.2.3.6 葡萄糖標準曲線的繪制

準確吸取葡萄糖標準溶液0.2、0.6、1.0、1.4、1.8mL，加水補足至2mL，制成濃度分別為12、36、60、84、108μg/mL的葡萄糖溶液，加入0.4mL 6%苯酚溶液，搖勻，迅速滴加4.5m L濃硫酸，60℃水浴10min，于493 nm測定吸光度，以標準葡萄糖溶液濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

1.2.3.7 苦瓜多糖含量的測定

準確吸取1mL苦瓜粗多糖溶液，加水補足至2mL，加入0.4mL 6%苯酚溶液，搖勻，迅速滴加4.5mL濃硫酸，60℃水浴10min，于493 nm測定吸光度，根據(jù)葡

式中：n為稀釋倍數(shù)；X為葡萄糖質(zhì)量濃度，（μg/mL）；V為樣品液的體積，mL；m為預(yù)處理后粗多糖質(zhì)量，g。1.2.4 方法學(xué)考察

1.2.4.1 精密度實驗

吸取苦瓜粗多糖溶液1mL，按照標準曲線制備方法測定吸光度，平行測定5次，比較5組結(jié)果，分析苯酚—硫酸法測苦瓜多糖含量的精密度[7]。

1.2.4.2 穩(wěn)定性實驗

吸取苦瓜粗多糖溶液1mL，按照標準曲線制備方法，每隔0.5 h記錄一次吸光度，連續(xù)記錄3h，比較6組結(jié)果，分析苯酚—硫酸法測苦瓜多糖含量的穩(wěn)定性[8]。

1.2.4.3 加樣回收率實驗

吸取苦瓜粗多糖溶液1mL 5份（試樣），各加入葡萄糖標準溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5m L（加標試樣），按照標準曲線制備方法測定吸光度，再根據(jù)標準曲線方程計算加樣回收率。計算公式為：回收率/%=[100（加標試樣測定值-試樣測定值）/加標量]%[9]。萄糖標準曲線計算苦瓜多糖濃度，再根據(jù)下述公式計算苦瓜多糖的提取率。

計算公式為：（趙寧等，2011）

2 結(jié)果與分析

2.1 苯酚—硫酸法測定苦瓜多糖含量條件的優(yōu)化

2.1.1 最大吸收波長

葡萄糖標準溶液和苦瓜多糖樣品溶液在400 nm～600 nm波譜掃描結(jié)果顯示，葡萄糖標準溶液在484 nm處有最大吸收，苦瓜多糖樣品溶液在493 nm處有最大吸收，后者更適合苯酚—硫酸法反應(yīng)體系，因此本實驗中選擇493 nm為測定波長。

2.1.2 最適濃硫酸用量

濃硫酸用量對苯酚—硫酸法測定苦瓜多糖含量影響如表1所示。

表1 濃硫酸用量對吸光度值的影響Table1 The in fluence of dosage of sulfuric acid on absorbancevalue

由表1可知，濃硫酸用量在3.0mL～4.5mL范圍內(nèi)，OD493隨濃硫酸用量增加而增加，在4.5mL時，OD493增加至最大值，5.0mL后OD493開始減小。這可能是因為隨著濃硫酸用量的增加，苦瓜多糖逐漸被碳化，不能水解成游離單糖，與苯酚反應(yīng)生成橙黃色化合物。因此，苯酚—硫酸法測定苦瓜多糖含量時，硫酸的添加量是測定結(jié)果穩(wěn)定性的一個重要影響因素，添加量過小或過大，顯色反應(yīng)皆不均勻。由上述數(shù)據(jù)可知，最適濃硫酸用量選擇4.5m L。

2.1.3 最適苯酚用量

苯酚用量對苯酚—硫酸法測定苦瓜多糖含量影響如表2所示。

表2 苯酚用量對吸光度值的影響Table2 The influence ofdosageof phenolon absorbancevalue

由表2可知，苯酚用量在0.2mL～0.4mL，OD493隨苯酚用量增加而增加，在0.4mL時，OD493增加至最大值，0.4mL后OD493開始減小。這可能是因為苯酚用量增加，濃硫酸先與苯酚反應(yīng)，與苦瓜多糖反應(yīng)量相應(yīng)減少，因此苯酚—硫酸法測定苦瓜多糖含量的最適苯酚用量選擇0.4m L。

2.1.4 顯色溫度

顯色溫度對苯酚—硫酸法測定苦瓜多糖含量影響如表3所示。

表3 顯色溫度對吸光度值的影響Table 3 The influenceof developing tem peratureon absorbancevalue

由表3可知，顯色溫度在20℃～80℃范圍內(nèi)，OD493隨顯色溫度增加而增加，60、70、80℃處的OD493值相對恒定，80℃后OD493開始減小。這是因為顯色溫度升高到苦瓜多糖保護溫度60℃及以上，苦瓜多糖活性結(jié)構(gòu)遭到破壞，不能與苯酚反應(yīng)生成橙黃色化合物。因此，苯酚—硫酸法測定苦瓜多糖含量的最適顯色溫度選擇60℃。

2.1.5 顯色時間

顯色時間對苯酚—硫酸法測定苦瓜多糖含量影響如表4所示。

表4 顯色時間對吸光度值的影響Table4 The influenceofdeveloping timeon absorbancevalue

由表4可知，顯色時間在5min～10min范圍內(nèi)，OD493隨顯色時間延長而增加，在10min時，OD493增加至最大值，10min后OD493開始減小。這是因為隨著顯色時間的延長，苯酚穩(wěn)定性降低，苦瓜多糖與之反應(yīng)量減少。因此，苯酚—硫酸法測定苦瓜多糖含量的最適顯色時間選擇10min較好。

2.1.6 葡萄糖標準曲線制作

根據(jù)葡萄糖質(zhì)量濃度和所測得的吸光度數(shù)據(jù)，以標準葡萄糖溶液濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線方程為：y=0.008 9x+0.005 0（其中y吸光度，x葡萄糖濃度），線性相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8，標準品在0～100μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，可較精確計算出苦瓜多糖含量。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 精密度實驗

精密吸取苦瓜粗多糖溶1mL，按照標準曲線制備方法測定吸光度，平行測定5次，計算相對標準偏差RSD值，實驗結(jié)果如表5所示。

表5 精密度實驗Table5 Precision of themeasured results

結(jié)果表明相對標準偏差RSD為1.312%＜2%，說明此測定方法精密度良好。

2.2.2 穩(wěn)定性實驗

精密吸取苦瓜粗多糖溶1mL，按照標準曲線制備方法測定吸光度，連續(xù)3 h內(nèi)檢測其穩(wěn)定性，結(jié)果如表6所示。

表6 穩(wěn)定性實驗Table6 Reproducibility of themeasured results

結(jié)果表明樣品的吸光度在3 h內(nèi)基本不變，相對標準偏差RSD=1.134%＜2%，顯色穩(wěn)定，說明此測定方法穩(wěn)定性較好。

2.2.3 加樣回收率實驗

吸取苦瓜粗多糖溶液1mL 5份（試樣），各加入葡萄糖標準溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5m L（加標試樣），按照標準曲線制備方法測定吸光度，再根據(jù)標準曲線方程計算加樣回收率。結(jié)果如表7所示。

表7 回收率實驗Table7 Recoveriesof themeasured results

由表7可知，采用苯酚—硫酸法測定苦瓜中多糖含量的加樣回收率較高，均值為98.69%，相對標準偏差RSD為2.04%＜3%，因此該方法準確度較高。

3 結(jié)論

以葡萄糖為標準品，苯酚—硫酸法測定苦瓜多糖含量的最佳條件為：最大吸收波長493 nm、6%苯酚0.4mL、濃硫酸4.5mL、顯色溫度60℃，顯色時間10 min，該方法平均回收率為98.69%，RSD為2.04%（n=5），樣品液在3 h內(nèi)顯色穩(wěn)定，操作簡單，條件易控制，重現(xiàn)性較好，對苦瓜中多糖含量的測定可獲得滿意的結(jié)果，既可用于固體樣品的多糖含量測定，亦可用于液體樣品的測定，是一種適用性廣，回收率高，穩(wěn)定性好的苦瓜多糖含量的測定方法[10-11]。

[1]袁祖華,粟建文,胡新軍,等.苦瓜的營養(yǎng)化學(xué)成分及保健功能研究進展[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué),2006,5:48-50

[2] 何新益,劉仲華.苦瓜多糖降血糖活性的高通量篩選研究[J].食品科學(xué),2007,28(2):313-316

[3] 黃婧,張名位,辛修鋒,等.苦瓜粗多糖提取工藝的優(yōu)化[J].農(nóng)業(yè)機械學(xué)報,2007,38(6):112-116

[4]張志軍,劉建華,李淑芳,等.靈芝多糖含量的苯酚硫酸法檢測研究[J].食品工業(yè)科技,2006,27(2):193-195

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[8]趙寧,問亞琴,潘秋紅.苯酚-硫酸法測定干紅葡萄酒中的多糖含量[J].中外葡萄與葡萄酒,2011,5:10-12.

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[10]巴媛媛,王瑩,樸美子.苯酚-硫酸法測定瓦尼木層孔菌菌絲體多糖含量的條件優(yōu)化[J].食品工業(yè)科技,2011,32(5):389-391

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Determ ination of M omordica Charantia Polysaccharide by Imp roved Phenol-su lfuric Acid Method

ZHANG Ju-zuo1，2，XUQiao-ling1，XU Jun-fei1，*
（1.Key LaboratoryofHunan Province forStudyand Utilization of Ethnic MedicinalPlantResources，Departmentof Life Science，HuaihuaUniversity，Huaihua 418008，Hunan，China；2.Veterinary Faculty，Hunan AgriculturalUniversity，Changsha 410128，Hunan，China）

The conditions for determinating momordica charantia polysaccharide by phenol-sulfuric acid method was studied.The results showed the optimum determinating conditionswere 1mL 1%polysaccharide solution and 0.4mL 6%phenol，4.5mL sulfuric acid color 10min at60℃，mensurating absorbance by using spectrophotometer at 493 nm.These procedures improved stability and repeatability of phenol-sulfuric acid method andwereeasy tooperate.

momordica charantiapolysaccharide；phenol-sulfuric acidmethod；determinate

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.05.021

2014-10-11

湖南省科技廳項目（2013NK4109）；湖南省重點學(xué)科建設(shè)項目資助（2011-42）；民族藥用植物活性成分高效利用湖南省高校創(chuàng)新團隊經(jīng)費資助（2010-53）

張居作（1981—），男（漢），碩士研究生，主要從事生物學(xué)研究。

*通信作者：徐君飛（1981—），女（漢），博士研究生，主要從事農(nóng)產(chǎn)品加工研究。