紫荊果總黃酮清除自由基作用研究

孫秀青

（鶴壁職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南鶴壁458030）

紫荊果總黃酮清除自由基作用研究

孫秀青

（鶴壁職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南鶴壁458030）

篩選紫荊果總黃酮的最佳提取工藝條件，研究紫荊果總黃酮提取液對(duì)羥自由基（·OH）清除活性，為紫荊潛在應(yīng)用價(jià)值的開發(fā)提供參考。采用乙醇浸提法提取紫荊果中總黃酮，初步探究乙醇濃度、料液比、浸提溫度、浸提時(shí)間4個(gè)單因素對(duì)紫荊果中總黃酮提取率的影響，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)確定紫荊果中總黃酮提取的較佳實(shí)驗(yàn)條件。通過(guò)與BHT的對(duì)照實(shí)驗(yàn)，初步探究了紫荊果中的總黃酮對(duì)羥自由基（·OH）的清除活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：料液比為1.5∶60（g/mL），浸提時(shí)間為2.5 h，浸提溫度為80℃，提取劑乙醇濃度為75%，此條件下總黃酮提取率可高達(dá)2.910%。對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示紫荊果中的總黃酮對(duì)羥自由基（·OH）清除活性高于相同濃度的BHT。紫荊果中總黃酮含量較高，且對(duì)羥自由基（·OH）具有較強(qiáng)的清除活性。

紫荊果；總黃酮；提取率；清除活性；羥自由基

近年來(lái)，由于自由基生命科學(xué)的進(jìn)展，使具有很強(qiáng)的抗氧化和消除自由基作用的黃酮類化合物受到空前的重視。黃酮類化合物是一類多酚類物質(zhì)，廣泛存在于高等植物及以植物為原料的食品中，是植物在長(zhǎng)期自然選擇過(guò)程中產(chǎn)生的一些次級(jí)代謝產(chǎn)物，參與了磷酸與花生四烯酸的代謝、蛋白質(zhì)的磷酸化、鈣離子的轉(zhuǎn)移、自由基的清除、抗氧化活力的增強(qiáng)、氧化還原作用、螯合作用和基因的表達(dá)，是一類極具開發(fā)前景的天然藥物[1-4]。

紫荊，屬豆科植物，因“其木似黃荊而色紫，故名。又名：滿條紅、烏桑、籮筐樹、紫金盤、扁頭翁。根皮（紫荊根皮）、木部（紫荊木）、花（紫荊花）、果實(shí)（紫荊果）可供藥用。研究發(fā)現(xiàn)，紫荊含有豐富的黃酮類化合物[5]。根據(jù)文獻(xiàn)調(diào)研，徐美奕等從紫荊花中分離、純化總黃酮，對(duì)其黃酮成分及含量進(jìn)行了光譜分析，進(jìn)行了紫荊花總黃酮提取工藝的優(yōu)化研究[6]。李君玲對(duì)紫荊皮總黃酮超聲提取工藝優(yōu)化進(jìn)行了研究[7]。到目前為止，鮮見有關(guān)紫荊果中總黃酮的研究報(bào)道，本研究對(duì)紫荊果中總黃酮的含量進(jìn)行了測(cè)定，并以總黃酮得率為考察指標(biāo)，優(yōu)化其醇沉提取工藝，并初步探究提取物的抗氧化性質(zhì)，即對(duì)羥自由基的清除活性，為紫荊在醫(yī)藥領(lǐng)域的潛在應(yīng)用及綜合開發(fā)利用提供數(shù)據(jù)參考。1 材料與儀器

紫荊果：采集于公園，洗凈，烘干，粉碎（備用）。

無(wú)水乙醇、蘆丁、二丁基羥基甲苯、水楊酸、氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉、硫酸亞鐵、雙氧水、氯化鐵。均為市購(gòu)，優(yōu)級(jí)純。

CP214C電子天平：德國(guó)賽多利斯；722N可見分光光度計(jì)：上海光學(xué)儀器廠；SHSG-3050型高速多功能粉碎機(jī)：上海碩光科技有限公司；202-0A電熱恒溫干燥箱：北京金志業(yè)儀器設(shè)備有限責(zé)任公司；HH.S11-Ni4電熱恒溫水浴鍋：北京三二八科學(xué)儀器有限公司。

2 方法

2.1 總黃酮提取率的計(jì)算方法

[8]進(jìn)行顯色反應(yīng)，用分光光度法測(cè)得吸光度值。吸光度與總黃酮濃度服從朗伯-比爾定律[9]。將所測(cè)吸光度值代入線性回歸方程求出提取液中總黃酮濃度，按下式計(jì)算總黃酮提取率：

總黃酮提取率=C×V1M×V2×50×10-3×100%

式中：V1為第二次定容后提取液的體積50mL；V2從母液中量取的提取液體積0.50mL；C為提取液中總黃酮濃度；M為樣品（紫荊果）質(zhì)量。

2.2 總黃酮對(duì)羥自由基的清除作用

參照Fenton反應(yīng)體系，利用H2O2與Fe2+混合后產(chǎn)生存活時(shí)間短，反應(yīng)活性高的羥自由基（·OH）的性質(zhì)，向反應(yīng)體系中加入水楊酸，水楊酸能有效捕捉·OH并與其反應(yīng)產(chǎn)生有色絡(luò)合物，該絡(luò)合物在波長(zhǎng)為510 nm處有強(qiáng)吸收。若向該體系中加入總黃酮，與水楊酸競(jìng)爭(zhēng)羥自由基，導(dǎo)致有色絡(luò)合物產(chǎn)生量減少。固定反應(yīng)時(shí)間，在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)紫荊果提取液的吸光度，與空白液對(duì)照，便能測(cè)定紫荊果中總黃酮對(duì)羥自由基的清除率。

3 結(jié)果與分析

3.1 最大吸收波長(zhǎng)的選擇

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液的配制：蘆丁標(biāo)準(zhǔn)樣在干燥箱中干燥至恒溫，用電子天平準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)樣品0.010 0 g，加70%乙醇溶液溶解，用相同濃度乙醇溶液定容到50mL容量瓶中，搖勻，即得0.2mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。

最大吸收波長(zhǎng)的選擇：用最大刻度為1mL的吸量管準(zhǔn)確吸取0.50mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液于50mL容量瓶中，顯色反應(yīng)參考文獻(xiàn)[9]。以試劑空白作參比，在460 nm～560 nm之間測(cè)定絡(luò)合物吸光度，確定最大吸收波長(zhǎng)。用最大刻度為1mL的吸量管準(zhǔn)確吸取0.50mL紫荊果提取液于50mL容量瓶中，顯色方法如前。以試劑空白作參比，在460 nm～560 nm之間測(cè)定絡(luò)合物吸光度，確定最大吸收波長(zhǎng)。

圖1分別為蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液和紫荊果中總黃酮提取液的吸收光譜。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液和總黃酮提取液的吸收光譜Fig.1 Theabsorption spectrum of diagram of Rutin solution and flavonoidsextracts

結(jié)果顯示隨著測(cè)定波長(zhǎng)的增大，吸光度值越來(lái)越大，在510 nm處有最大吸收峰，而后隨著波長(zhǎng)增加，吸光度值反而逐漸減小，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定510 nm為黃酮類物質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)，此后的吸光度值均在此最大吸收波長(zhǎng)下測(cè)定。

3.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確吸取0.2 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0.00、2.50、3.50、4.50、5.50、6.50mL分別置于50mL容量瓶中，各加入5%亞硝酸鈉溶液0.40m L，搖勻，靜置6min；加10%硝酸鋁溶液0.40mL，搖勻，靜置6 min；加4%氫氧化鈉溶液5.00mL，用濃度為70%的乙醇溶液定容至50.00mL，搖勻，靜置10min。在510 nm波長(zhǎng)處以試劑空白為參比測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得回歸方程，見圖2。

圖2 蘆丁溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The standard curveof rutin solu tion

由蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為A=-0.005 3+ 0.245 8C，R2=0.999 04。

3.3 紫荊果中總黃酮提取及定性實(shí)驗(yàn)

3.3.1 紫荊果中總黃酮的提取

準(zhǔn)確稱取2.000 0 g的紫荊果粉末，用60mL濃度為75%的乙醇溶液做提取劑，水浴浸提2 h，將提取液過(guò)濾，用相同濃度的乙醇溶液洗滌并定容至50mL容量瓶中，即得總黃酮提取液。

3.3.2 總黃酮提取液定性實(shí)驗(yàn)

鋁鹽反應(yīng)：用量筒量取提取液、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液各2.0 m L于2支小試管中，各滴加幾滴1%硝酸鋁溶液，振蕩，觀察實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象。

氫氧化鈉反應(yīng)：用量筒量取提取液、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液各2.0m L于2支小試管中，各滴加幾滴4%氫氧化鈉溶液，振蕩，觀察實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象。

鐵離子反應(yīng)：用量筒量取提取液、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液各2.0m L于2支小試管中，各滴加幾滴5%三氯化鐵溶液，振蕩，觀察實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象。

3.3.3 定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

對(duì)紫荊果提取液和蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)行顯色反應(yīng)，結(jié)果如表1所示。

表1 總黃酮提取液與蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的顏色反應(yīng)Table1 Chromogenic reaction of flavonoidsextractsand rutin solution

通過(guò)顯色結(jié)果對(duì)比：紫荊果提取液顯色反應(yīng)現(xiàn)象與黃酮類化合物的顯色一致，說(shuō)明提取液中含有黃酮類化合物。

3.4 單因素試驗(yàn)及結(jié)果分析

3.4.1 乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的影響

準(zhǔn)確稱取2.000 0 g的紫荊果粉末，固定料液比為2∶60（g/mL），改變提取劑乙醇濃度分別為55%、60%、65%、70%、75%、80%，在80℃恒溫水浴中浸提2 h，將提取液冷卻至室溫過(guò)濾、洗滌、合并提取液和洗滌液，并用與提取劑相同濃度的乙醇溶液在50mL容量瓶中定容。乙醇提取液的顯色反應(yīng)方法如前，在510nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度，做3組平行實(shí)驗(yàn)。將吸光度的平均值代入線性回歸方程，計(jì)算提取液中總黃酮濃度和紫荊果中總黃酮提取率，選擇較佳的提取劑（乙醇）濃度。

由圖3可知，乙醇濃度在55%～70%之間，吸光度值逐漸增加，乙醇濃度在70%～80%之間，吸光度值逐漸降低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)乙醇濃度為70%時(shí)，吸光度值達(dá)到最大，總黃酮提取率最高。即紫荊果中提取總黃酮，提取劑乙醇的較佳濃度為70%。

圖3 乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.3 Effection of ethanol concentration on the extraction ratio of total flavonoids

3.4.2 料液比對(duì)總黃酮提取率的影響

準(zhǔn)確稱取2.000 0 g的紫荊果粉末，固定提取劑乙醇的濃度為70%，改變料液比分別為：1.0∶60、1.5∶60、2.0∶60、2.5∶60、3.0∶60（g/mL），在80℃的恒溫水浴中浸提2 h，將提取液冷卻至室溫過(guò)濾、洗滌、合并提取液和洗滌液，并用與提取劑相同濃度的乙醇溶液在50mL容量瓶中定容。乙醇提取液的顯色反應(yīng)方法如前，在510 nm處測(cè)吸光度，平行測(cè)定3次，取平均值，代入回歸方程，計(jì)算紫荊果提取液中總黃酮濃度和紫荊果中總黃酮提取率，選擇較佳的料液比。

圖4 料液比對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.4 Effection of solid-liquid ratio on theextraction ratio of total flavonoids

由圖4可知，料液比為2.0∶60（g/mL）時(shí)，測(cè)定提取液的吸光度值最大，即總黃酮提取率最高，結(jié)果顯示紫荊果中提取總黃酮的較佳料液比為2.0∶60（g/mL）。

3.4.3 浸提溫度對(duì)總黃酮提取率的影響

準(zhǔn)確稱取2.000 0 g的紫荊果粉末，固定提取劑乙醇濃度為70%，料液比為2.0∶60（g/mL），在溫度分別為50、60、70、80、85、90℃的恒溫水浴中浸提2 h，將提取液冷卻至室溫過(guò)濾、洗滌、合并提取液和洗滌液，并用與提取劑相同濃度的乙醇溶液在50mL容量瓶中定容，乙醇提取液的顯色反應(yīng)方法如前，平行測(cè)定3次，取平均值，代入回歸方程，計(jì)算紫荊果提取液中總黃酮濃度和紫荊果中總黃酮提取率，選擇較佳的浸提溫度。

圖5 浸提溫度對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.5 Effection of temperatureon the extraction ratio of total flavonoids

由圖5可知，在50℃～80℃之間，總黃酮提取率隨溫度升高而增加，浸提溫度高于80℃，總黃酮提取率隨著溫度升高而降低，探究其原因可能是溫度升高引起的溶劑揮發(fā)損耗。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示紫荊果中提取總黃酮，80℃為較佳的浸提溫度。

3.4.4 浸提時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響

準(zhǔn)確稱取2.000 0 g的紫荊果粉末，固定提取劑乙醇的濃度為70%，料液比為2.0∶60（g/mL），在80℃的恒溫水浴中分別浸提1.0、1.5、2、2.5、3 h。將提取液冷卻至室溫過(guò)濾、洗滌、合并提取液和洗滌液，用與提取劑相同濃度的乙醇溶液在50mL容量瓶中定容。乙醇提取液的顯色反應(yīng)方法如前。平行測(cè)定3次，取平均值，代入回歸方程，計(jì)算紫荊果提取液中總黃酮濃度和紫荊果中總黃酮提取率，選擇較佳的浸提時(shí)間。

圖6 提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率影響Fig.6 Effection of reflux tim eon theextraction ratio of total flavonoids

由圖6可知，總黃酮提取率開始隨著時(shí)間延長(zhǎng)而增加，當(dāng)時(shí)間超過(guò)2.0 h后，總黃酮提取率隨著時(shí)間延長(zhǎng)而降低。探究其原因可能是隨著時(shí)間延長(zhǎng)提取劑乙醇的揮發(fā)損耗。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示紫荊果中總黃酮提取的較佳浸提時(shí)間為2.0 h。

3.5 正交試驗(yàn)及結(jié)果分析

在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，以黃酮提取率為綜合考察指標(biāo)，選定料液比、浸提時(shí)間、浸提溫度、乙醇濃度四因素，每個(gè)因素3個(gè)水平，設(shè)計(jì)L9（34）表進(jìn)行正交試驗(yàn)，優(yōu)化紫荊果中總黃酮提取工藝條件。因素水平見表2，正交試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表2 L9（34）正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)Table2 Factorsand levelsof L9（34）orthogonalexperiment

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果Table3 The resultoforthogonalexperiment

從表3可以看出，本試驗(yàn)中A、B、C、D四個(gè)單因素的主次關(guān)系是C＞B＞A＞D，即C（浸提溫度）為最重要的因素，其次是B（浸提時(shí)間），再次是A（料液比），D（乙醇濃度），影響最小。正交試驗(yàn)結(jié)果顯示，以總黃酮提取率為考察指標(biāo)，最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件組合是A1B3C2D3。即料液比為1.5∶60（g/m L），浸提時(shí)間為2.5 h，浸提溫度為80℃，提取劑乙醇濃度為75%。

按照正交試驗(yàn)所確定的最佳提取條件進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)，做3次平行試驗(yàn)，計(jì)算得到紫荊果中總黃酮提取率為2.910%。

3.6 紫荊果中總黃酮對(duì)羥基自由基的清除作用

參考Fenton反應(yīng)體系，加入不同體積的總黃酮提取液，在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度[8]。扣除提取液的本底吸收。做3次平行試驗(yàn)，計(jì)算提取液中總黃酮對(duì)羥自由基的清除率。清除率計(jì)算公式：

式中：A0為空白對(duì)照溶液吸光度；Ax為提取液吸光度；Ax0為不加H2O2提取液的本底吸光度。

以BHT（二丁基羥基甲苯）為對(duì)照，比較兩種抗氧化劑對(duì)·OH的清除活性。對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖7。

圖7 紫荊果總黃酮提取液對(duì)羥基自由基的清除率Fig.7 Liquid of hydroxyl radicalscavenging rateof extraction of total flavonoids from fruitof Chinese redbud

由圖7可知：紫荊果中的總黃酮提取液對(duì)羥基自由基（·OH）有清除能力，隨著提取液體積增加，清除率也逐漸增加。從圖中可以看出：當(dāng)加入與提取液相同體積的BHT情況下，紫荊果中的總黃酮提取液對(duì)羥基自由基（·OH）的清除率要高于BHT（二丁基羥基甲苯）對(duì)羥自由基（·OH）的清除率。

4 討論

利用乙醇單次浸提紫荊果中總黃酮，采用分光光度法測(cè)得總黃酮含量為2.910%。與文獻(xiàn)中報(bào)道的通過(guò)醇沉法提取純化紫荊花中黃酮類化合物，測(cè)得總黃酮回收率為7.32%。提取液的抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，紫荊果中總黃酮對(duì)羥自由基有較強(qiáng)的清除活性。紫荊果與花、皮一樣，同樣具有較高的利用價(jià)值，有待開發(fā)。

5 結(jié)論

采用乙醇浸提法提取紫荊果中的總黃酮，設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)和L9（34）正交試驗(yàn)初步確定了紫荊果中總黃酮提取的較佳實(shí)驗(yàn)條件：料液比為1.5∶60（g/mL），浸提時(shí)間為2.5 h，浸提溫度為80℃，提取劑乙醇濃度為75%。在此條件下總黃酮提取率可高達(dá)2.910%。

還對(duì)紫荊果中的總黃酮提取液抗氧化性質(zhì)做了初步探究，對(duì)紫荊果中的總黃酮提取液和BHT對(duì)羥自由基（·OH）清除活性作了比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：紫荊果提取液對(duì)羥基自由基（·OH）的清除能力要高于BHT（二丁基羥基甲苯）。

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Study on Scavenging Free Radical of Total Flavonoidsof Cercis Chinensis Bunge

SUN Xiu-qing
（HebiVocationalCollege，Hebi458030，Henan，China）

To optimize the extraction of total flavonoids in Cercis chinensis Bunge and study on the scavenging effecton hydroxyl radicals provide a preparation for potential application.In this study，flavonoids from Cercis chinensis Bungewere extracted by using ethanol.The preferred extraction conditionswere determined by single factor experiment and orthogonal experiment.The experiment reveals that：ethanol concentration of 75%，solid-liquid ratio of1.5∶60（g/mL），temperaturewas80℃and extraction timewas2.5 h.The extraction ratio of flavonoids reached up to 2.910%by using spectrophotometry.Antioxidanteffectsof flavonoidsand BHTwere measured to remove hydroxyl radicals by comparative experiments.Antioxidant experiments showed that flavonoids from CercischinensisBungehavea strongscavengingeffecton hydroxyl radicals.

CercischinensisBunge；flavonoids；extraction ratio；scavengingeffect；hydroxyl radicals

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.05.018

2013-11-19

2012河南省科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（122102110236）

孫秀青（1971—），女（漢），副教授，碩士研究生，研究方向：生物技術(shù)。