BUCY預(yù)處理小鼠異基因骨髓移植后aGVHD模型的建立

程婷婷，周琳，梁彬，陳慧瑤，俞康

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 血液科，浙江 溫州 325015；2.武漢市普仁醫(yī)院 檢驗(yàn)科，湖北 武漢430081）

·論 著·

BUCY預(yù)處理小鼠異基因骨髓移植后aGVHD模型的建立

程婷婷1，2，周琳1，梁彬1，陳慧瑤1，俞康1

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 血液科，浙江 溫州 325015；2.武漢市普仁醫(yī)院 檢驗(yàn)科，湖北 武漢430081）

目的：建立白消安（BU）聯(lián)合環(huán)磷酰胺（CY）化療預(yù)處理的小鼠異基因造血干細(xì)胞移植（allo-HSCT）后急性移植物抗宿主?。╝GVHD）的小鼠動(dòng)物模型。方法：BALB/C受鼠以BUCY方案化療預(yù)處理，根據(jù)化療劑量分3組：1～4 d分別予BU 35、38、40 mg·kg-1·d-1，5～6 d予CY 100 mg·kg-1·d-1，第8天尾靜脈回輸C57BL/6供鼠骨髓細(xì)胞（2×107個(gè)）和脾細(xì)胞（2×107個(gè)），移植后定期觀察記錄受鼠一般情況等以判斷aGVHD的程度。結(jié)果：BU劑量為40 mg·kg-1·d-1受鼠組小鼠移植后體質(zhì)量進(jìn)行性下降，移植后6 d內(nèi)全部死亡。BU劑量為35 mg·kg-1·d-1受鼠組觀察到輕微aGVHD的臨床癥狀，小鼠長期存活。BU劑量為38 mg·kg-1·d-1受鼠組觀察到典型aGVHD臨床癥狀及病理改變。結(jié)論：經(jīng)BUCY（BU 38 mg·kg-1·d-1+CY 100 mg·kg-1·d-1）方案預(yù)處理后回輸異基因骨髓細(xì)胞（2×107個(gè)）和脾細(xì)胞（2×107個(gè)）能成功構(gòu)建aGVHD實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。

移植物抗宿主??；異基因造血干細(xì)胞移植；化療

異基因造血干細(xì)胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT）是治療血液惡性腫瘤最有效的方法[1-2]，然而，急性移植物抗宿主?。╝cute graft-versus-host disease，aGVHD）是移植最常見的并發(fā)癥，是移植失敗的主要原因之一[3]。臨床上超過60%患者在移植前采用化療作為預(yù)處理方案，臨床研究表明預(yù)處理?xiàng)l件可影響移植后GVHD的發(fā)生發(fā)展情況[4]。在GVHD研究中，大部分aGVHD模型采用全身輻射作為移植前的預(yù)處理手段[5]，只有少數(shù)研究采用了化療作為預(yù)處理[6]。因此迫切需要建立化療預(yù)處理的aGVHD動(dòng)物模型，為深入研究aGVHD的病理生理機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 供鼠為純種近交系C57BL/6（H-2b）小鼠，雄性黑色，組織相容性抗原（H-2）為b型。受鼠為純種近交系BALB/C（H-2d）小鼠，雌性白色，組織相容性抗原（H-2）為d型，6～8周齡，體質(zhì)量18～22 g。均購于溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)于SPF級動(dòng)物房內(nèi)。

1.2 主要試劑與儀器 二甲亞砜（DMSO）、白消安（busulfan，BU）粉劑、環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，CY）購自美國Sigma公司，慶大霉素購自上?，F(xiàn)代哈森藥業(yè)有限公司，Anti-Mouse MHC Class I（H-2Kb）FITC、Anti-Mouse MHC Class I（H-2Kd）PE購自eBioscience公司，RPMI 1640培養(yǎng)液購自Gibco公司，生物凈化工作臺購自北京中化生物技術(shù)研究所，倒置顯微鏡CX21FS1購自O(shè)lympus公司，EP管、離心管購自Corning公司，電子天平GB303購自瑞士Mettler Toledo公司，流式細(xì)胞儀購自BD公司，臺式高速離心機(jī)購自貝克曼公司，

1.3 方法

1.3.1 受鼠分組及化療預(yù)處理：對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物aGVHD模型進(jìn)行分組，見表1。將BALB/C小鼠隨機(jī)分為6組，每組10只，分別稱質(zhì)量。A組、B組、C組為異基因移植組（C57BL/6→BALB/C），BU劑量分別為40、38、35 mg·kg-1·d-1，腹腔注射4 d（移植前7 d～移植前4 d），CY劑量均為100 mg·kg-1·d-1，腹腔注射2 d（移植前3 d～移植前2 d），完成整個(gè)預(yù)處理過程。D組為同基因移植組（BALB/C→BALB/C），E組為單純預(yù)處理組BALB/C，未進(jìn)行骨髓移植，F(xiàn)組為DMSO對照組BALB/C，未進(jìn)行化療預(yù)處理，移植前7 d～移植前4 d予含DMSO的0.9%氯化鈉溶液腹腔注射，移植前3 d～移植前2 d予0.9%氯化鈉溶液腹腔注射。

表1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組情況及化療預(yù)處理

1.3.2 受鼠的術(shù)前準(zhǔn)備：各組受鼠移植前5 d（-5 d）飲用含慶大霉素（320 mg/L）無菌水，持續(xù)至移植后3周，進(jìn)行腸道凈化。

1.3.3 供鼠骨髓細(xì)胞及脾細(xì)胞制備：頸椎脫位法處死供鼠，用75%乙醇浸泡小鼠消毒。超凈臺內(nèi)無菌切取脾臟、股骨及脛骨。脾臟用眼科剪剪成小塊后在200目金屬網(wǎng)上輕輕研磨，裂解紅細(xì)胞，RPMI 1640液沖洗過濾制成單細(xì)胞懸液，將濃度調(diào)成1× 108/mL備用。剪開股骨、脛骨兩端骨骺，沖洗骨髓腔，200目金屬網(wǎng)過濾，裂解紅細(xì)胞后制備單細(xì)胞懸液，調(diào)細(xì)胞濃度為1×108/mL備用，兩種細(xì)胞臺盼藍(lán)染色活細(xì)胞計(jì)數(shù)＞95%。

1.3.4 造血干細(xì)胞移植：受鼠在接受6 d的BUCY化療預(yù)處理后第8天按無菌操作要求，A組、B組、C組、D組受鼠尾靜脈注入骨髓和脾細(xì)胞懸液0.4 mL（含2×107個(gè)骨髓細(xì)胞和2×107個(gè)脾淋巴細(xì)胞的混合細(xì)胞懸液），E組、F組注入RPMI 1640 0.4 mL。

1.3.5 aGVHD的觀測指標(biāo)：①植入觀察指標(biāo)：移植后每天稱體質(zhì)量，繪制體質(zhì)量變化曲線，觀察小鼠的生存期，計(jì)算生存率。移植后每3 d檢測白細(xì)胞，繪制白細(xì)胞變化曲線。存活超過30 d，體質(zhì)量、飲食及活動(dòng)正常者可視為長期生存。②臨床GVHD評分：觀察各移植組小鼠有無腹瀉、體質(zhì)量下降、弓背、活動(dòng)度下降及皮膚脫毛潰瘍等臨床表現(xiàn)予以評分[7]；臨床指數(shù)為5項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)的分?jǐn)?shù)總和，最高為10分，臨床評分＞5分為重度GVHD，3～5分為中度GVHD，＜3分為輕度GVHD，見表2。③病理檢查：取瀕死小鼠的皮膚、小腸及肝臟組織作病理切片HE染色，光鏡下觀察，按Thomas GVHD病理組織學(xué)分級標(biāo)準(zhǔn)[8]判定，見表3。

表2 移植動(dòng)物GVHD的臨床評分

1.3.6 aGVHD判定標(biāo)準(zhǔn)：①aGVHD發(fā)生：外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)＞0.5×109/L；并有體質(zhì)量減輕、弓背、脫毛及豎毛、腹瀉、倦怠、精神萎靡等aGVHD癥狀；病理檢查可見皮膚、肝、腸等臟器出現(xiàn)aGVHD相應(yīng)改變。②移植失?。赫丈浜蠛芸焖劳?，死亡時(shí)外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)＜0.5×109/L。③移植后感染：外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)＞0.5×109/L，顯微鏡下可見外周血胞漿中有中毒顆粒。④造血重建：受鼠狀態(tài)好，體質(zhì)量增加，其外周血白細(xì)胞＞0.5×109/L。⑤造血衰竭：死亡時(shí)外周血白細(xì)胞＜0.5×109/L。⑥長期生存：小鼠造血免疫重建，生存期＞30 d，體質(zhì)量、活動(dòng)、飲食等均正常。

表3 aGVHD病理組織學(xué)分度

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用表示，多組計(jì)量數(shù)據(jù)比較先進(jìn)行正態(tài)性及多個(gè)方差齊性檢驗(yàn)，滿足條件的采用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠一般情況和生存期 A組小鼠化療預(yù)處理（BU 40 mg·kg-1·d-1）后體質(zhì)量進(jìn)行性下降，移植后6 d內(nèi)全部死亡，未見aGVHD典型癥狀。B組小鼠化療預(yù)處理（BU 38 mg·kg-1·d-1）后陸續(xù)出現(xiàn)aGVHD癥狀，移植后第12天開始出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，中位生存期15.5 d。C組小鼠化療預(yù)處理（BU 35 mg· kg-1·d-1）后出現(xiàn)體質(zhì)量進(jìn)行性下降，出現(xiàn)輕微aGVHD癥狀，全部小鼠生存時(shí)間＞30 d。D組開始體質(zhì)量變化同B組，后逐漸恢復(fù)正常狀態(tài)良好，存活時(shí)間均＞30 d以上。E組小鼠體質(zhì)量進(jìn)行性下降，化療后第6天開始死亡，第10天全部死亡。F組小鼠在整個(gè)觀察期內(nèi)（移植前7 d～移植后30 d）一般情況良好，長期存活。小鼠體質(zhì)量、白細(xì)胞、生存率變化見圖1-3。

2.2 異基因移植組嵌合體表達(dá) 移植前7 d與移植后20 d，分別取B組、C組小鼠外周血，流式細(xì)胞儀檢測組織相容性抗原表達(dá)。B組移植前測得僅表達(dá)自身組織相容性抗原H-2Kd，見圖4A。移植后測得供者組織相容性抗原H-2Kb表達(dá)均達(dá)到95%，見圖4B。受者小鼠由于供者細(xì)胞大量植入發(fā)生明顯aGVHD癥狀，aGVHD模型構(gòu)建成功。C組移植前僅表達(dá)自身組織相容性抗原H-2Kd，移植后測得供者組織相容性抗原H-2Kb表達(dá)低于95%，說明供者細(xì)胞未植入，見圖4C。

圖1 各組小鼠體質(zhì)量變化曲線（g）

圖2 不同化療劑量下小鼠的生存曲線（Kaplan-Meier法）

圖3 各組小鼠白細(xì)胞變化曲線（×109/L）

2.3 異基因移植后組織病理學(xué)改變 B組小鼠在移植后病理表現(xiàn)為皮膚組織中有廣泛的淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤，組織疏松水腫，基底層細(xì)胞空泡形成，見圖5A；腸管黏膜上皮壞死脫落，黏膜下層充血水腫，黏膜下層與固有層有較多淋巴細(xì)胞浸潤，隱窩有變性壞死或消失，絨毛結(jié)構(gòu)破壞，腺體有淋巴細(xì)胞浸潤等，見圖5B；肝臟匯管區(qū)及肝竇擴(kuò)張、淤血，匯管區(qū)炎癥反應(yīng)，毛細(xì)膽管周圍有大量淋巴細(xì)胞浸潤，肝細(xì)胞灶性壞死，見圖5C-D。病理檢查符合Thomas GVHD病理分級 II- III級改變。C組小鼠皮膚、肝臟、小腸病理檢查未見明顯異常。

3 討論

allo-HSCT是目前治愈惡性血液病的有效途徑，但GVHD仍然是allo-HSCT患者死亡的重要原因[9]。GVHD的發(fā)生機(jī)制主要是由于植入的供者T淋巴細(xì)胞識別受者的抗原，產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答而使受者的組織受損，其中皮膚、肝臟和胃腸道為最主要的受損器官[10-11]。

圖4 異基因移植組嵌合體表達(dá)

圖5 皮膚、腸道、肝臟GVHD病理HE染色（A：×40；B：×100；C：×100；D：×400）

建立穩(wěn)定、具有典型GVHD癥狀和病理改變的aGVHD動(dòng)物模型是進(jìn)行GVHD防治研究的基礎(chǔ)。過去30年，HSCT動(dòng)物模型被廣泛應(yīng)用于闡明aGVHD的發(fā)病機(jī)制和探索治療方法[12-13]，幾乎所有模型都是用全身輻射作為HSCT前的預(yù)處理方法[14-15]。本課題組前期研究中，已經(jīng)成功構(gòu)建了全身輻射為基礎(chǔ)的異基因骨髓移植aGVHD動(dòng)物模型。然而，臨床上＞50%的患者都是采用的化療為基礎(chǔ)的預(yù)處理方案，一些臨床試驗(yàn)也報(bào)道了aGVHD發(fā)展過程中預(yù)處理方法的關(guān)鍵性[4，16]。而對化療作為預(yù)處理方法的移植動(dòng)物模型的研究卻很少。

國外的研究表明100～150 mg/kg的BU劑量已經(jīng)足夠誘導(dǎo)清髓和/或完全供者植入[17-18]。Sadeghi等[6]研究了化療作為aGVHD的預(yù)處理方案，以C57BL/6（H-2kd）或雄性BALB/C小鼠為供鼠，雌性BALB/C（H-2kb）為受鼠，BUCY方案預(yù)處理，移植物包含2×107個(gè)骨髓細(xì)胞和3×107個(gè)脾細(xì)胞。移植后評估GVHD臨床表現(xiàn)和組織病理學(xué)改變。皮膚、腸道、肝臟的嵌合型和供者T細(xì)胞表達(dá)用流式、FISH、免疫組織化學(xué)分析。發(fā)現(xiàn)移植后7 d異基因移植小鼠表現(xiàn)出GVHD嚴(yán)重的病理表現(xiàn)和臨床表現(xiàn)，伴隨著GVHD進(jìn)展供體T細(xì)胞在受體皮膚腸道積累。與同基因組相比，異基因移植組靶器官內(nèi)細(xì)胞凋亡、T淋巴細(xì)胞浸潤顯著增高，同基因移植組未觀察到化療毒性和GVHD表現(xiàn)。有研究表明以供鼠骨髓與外周淋巴細(xì)胞1∶1混合進(jìn)行的異基因骨髓移植，100%引出致死性的aGVHD[19-20]。

本課題C組小鼠移植后出現(xiàn)體質(zhì)量下降，伴活動(dòng)減少，而后逐漸恢復(fù)，有弓背等輕微aGVHD癥狀。隨機(jī)抽取3只小鼠測得嵌合體均未植入，小鼠的生存時(shí)間均＞30 d。表明此時(shí)BU劑量過低，供者細(xì)胞未植入。A組小鼠移植后體質(zhì)量進(jìn)行性下降，移植后6 d內(nèi)全部死亡，死亡時(shí)白細(xì)胞計(jì)數(shù)＜0.5×109/L，未見明顯aGVHD癥狀。表明此劑量過大，小鼠未能出現(xiàn)aGVHD癥狀就已死亡，死于造血衰竭。B組小鼠移植后陸續(xù)出現(xiàn)體質(zhì)量下降、弓背、脫毛等aGVHD典型癥狀。隨機(jī)抽取3只小鼠測得嵌合體均植入且＞95%，皮膚、肝臟、腸道病理亦符合GVHD的病理改變。表明B組化療劑量既能達(dá)到較好的清髓狀態(tài)，又不會(huì)因過量而致死。

本實(shí)驗(yàn)以雄性C57BL/6為供鼠，雌性BALB/C為受鼠，采用BU 38 mg·kg-1·d-1（4 d），加CY 100 mg·kg-1·d-1（2 d）成功建立了化療預(yù)處理的小鼠aGVHD實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，其重?fù)性好，方法簡便可行，為研究aGVHD提供可靠的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物平臺。

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（本文編輯：吳彬）

Estabshment of acute graft versus host disease model after BUCY conditioning regimen in allogeneictransplanted mice

CHENG Tingting1,2, ZHOU Lin1, LIANG Bin1, CHEN Huiyao1, YU Kang1. 1.Depantmentof Hematology, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015; 2.Department of Clinical Laboratory, Wuhan Puren Hospital, Wuhan, 430081

Objective: To establish an acute graft-versus-host disease experimental animal model after allogeneic hematopoietic were stem cell transplantation conditioned with busulfan (BU) and cyclophosphamide (CY). Methods: BALB/C Recipients were divided into three groups accarding to 3 different doses of BU (35, 38, 40 mg?kg-1?d-1) for 4 days, followed by CY (100 mg?kg-1?d-1) for 2 days. On the 8th day recipient mice received bone marrow cells (2×107) and splenocytes (2×107) from the C57BL/6 donors. All recipients were monitored daily after hematopoietic stem cell transplantation for clinical manifestations of aGVHD. Results: The recipients conditioned with BU of 40 mg?kg-1?d-1exhibited progressive weight loss and all died within 6 days after reinfusion. The recipients received BU of 35 mg?kg-1?d-1had no significant clinical manifestations of aGVHD with long-term survival. The recipients conditioned with BU dose of 38 mg?kg-1?d-1exhibited severe aGVHD typical clinical symptoms and pathology manifestation. Conclusion: Through a BUCY-based conditioning regimen (BU 3 mg?kg-1?d-1+CY 100 mg?kg-1?d-1) together with the reinfusion of bone marrow cells (2×107) and splenocytes (2×107), aGVHD experimental animal model can be established.

graft-versus-host disease; allogeneic hematopoietic stem cell transplantation; chemotherapy

R457.7

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.07.003

2014-11-04

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81172613）；浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（Y12H080012，Y2101069）。

程婷婷（1987-），女，湖北襄陽人，碩士。

俞康，教授，博士生導(dǎo)師，Email：yukang602@126. com。