沉默黏著斑激酶表達(dá)抑制大腸癌轉(zhuǎn)移的體內(nèi)研究

洪衛(wèi)文，蘇國強(qiáng)，應(yīng)紅安，林峰，梁衛(wèi)東

（1.臺(tái)州市第一人民醫(yī)院 普外科，浙江 臺(tái)州 318020；2.廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院 普外科，福建 廈門361000；3.臺(tái)州市第一人民醫(yī)院 特需VIP科，浙江 臺(tái)州 318020）

·論 著·

沉默黏著斑激酶表達(dá)抑制大腸癌轉(zhuǎn)移的體內(nèi)研究

洪衛(wèi)文1，蘇國強(qiáng)2，應(yīng)紅安3，林峰1，梁衛(wèi)東1

（1.臺(tái)州市第一人民醫(yī)院 普外科，浙江 臺(tái)州 318020；2.廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院 普外科，福建 廈門361000；3.臺(tái)州市第一人民醫(yī)院 特需VIP科，浙江 臺(tái)州 318020）

目的：通過裸鼠實(shí)驗(yàn)研究，證實(shí)沉默黏著斑激酶（FAK）的表達(dá)能有效抑制大腸癌的轉(zhuǎn)移。方法：將24只裸鼠隨機(jī)分成3組：實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組、未處理組，分別注射FAK穩(wěn)定沉默的結(jié)腸癌細(xì)胞、陰性對(duì)照組的結(jié)腸癌細(xì)胞、未特殊處理的結(jié)腸癌細(xì)胞，每組各8只裸鼠。在SPF條件動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)6周后處死裸鼠，觀察原位成瘤率、病死率、瘤體生長、肝肺轉(zhuǎn)移情況，通過HE染色、免疫組織化學(xué)染色研究FAK微轉(zhuǎn)移灶、蛋白表達(dá)情況。結(jié)果：各組成瘤率均為100%。與陰性對(duì)照組及未處理組相比，實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)移率、病死率和FAK蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05），且轉(zhuǎn)移灶惡變程度更低、形態(tài)更好，而陰性對(duì)照組與未處理組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論：通過shRNA介導(dǎo)的FAK基因沉默對(duì)SW620原位移植后的裸鼠肝肺轉(zhuǎn)移有明顯抑制，F(xiàn)AK有望成為治療大腸癌轉(zhuǎn)移的新靶點(diǎn)。

黏著斑激酶；SW620；大腸腫瘤；裸鼠；轉(zhuǎn)移

大腸癌是常見的惡性腫瘤，包括結(jié)腸癌和直腸癌，是西方國家的第二大惡性腫瘤，中國第三大惡性腫瘤，發(fā)病率逐年升高。每年約有50%的腸癌患者發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移。即使少數(shù)患者能早期發(fā)現(xiàn)，并予積極的手術(shù)治療和化療，其中仍有19%發(fā)生轉(zhuǎn)移，5年生存率只有63%，而很多患者一經(jīng)確診已為晚期，5年生存率都不到10%[1-5]。大腸癌患者的主要死因在于腫瘤轉(zhuǎn)移，近年來，各種靶向藥物如貝伐單抗、西妥昔單抗和帕尼單抗等通過抑制腫瘤細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、黏附、遷移等途徑抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，取得較好療效[4]。而黏著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)是最重要的腫瘤細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一。

本課題組前期體外實(shí)驗(yàn)研究已成功構(gòu)建穩(wěn)定FAK沉默的細(xì)胞株，并通過RT-PCR及Western blot技術(shù)證實(shí)FAK沉默能有效抑制人源結(jié)腸癌株SW620的增殖及侵襲[5]。為探討其體內(nèi)抑癌作用，本研究建立裸鼠盲腸原位移植癌模型，進(jìn)一步研究shRNA（short hairpin RNA，短發(fā)夾RNA）沉默F(xiàn)AK基因表達(dá)對(duì)大腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的體內(nèi)作用，該模型能很好地模擬人大腸癌的生物學(xué)行為，是研究大腸癌轉(zhuǎn)移、治療的理想動(dòng)物模型。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)6周齡、體質(zhì)量18～20 g雌性裸鼠24只購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，許可證號(hào)：SCXK（滬）2007-0005。

1.2 主要儀器和試劑 倒置顯微鏡（日本Olympus公司），質(zhì)粒小抽試劑盒（美國Qiangen公司），新生小牛血清、DMEM、Polybrene、G418、NEAA、RMPI 1640（美國Gibco公司），氨芐青霉素、TEMED（美國Sigma公司），TurboFect（美國Fermentas公司），PVDF膜、鼠抗人FAK、Matrigel（美國Millipore公司），Tris（美國Boehringer Mannheim公司），羊抗鼠二抗（武漢博士德生物公司），F(xiàn)AK抗體一抗（上海吉?jiǎng)P公司），二抗（廈門鷺隆生物科技發(fā)展有限公司），免疫組織化學(xué)試劑盒（福州邁新生物科技有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 穩(wěn)定FAK沉默結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620的建立：本課題組前期體外實(shí)驗(yàn)研究將已構(gòu)建好插入FAK shRNA的慢病毒載體pLL3.7及插入無意義片段的陰性對(duì)照慢病毒載體pLL3.7，分別感染SW620結(jié)腸癌細(xì)胞，使用熒光倒置顯微鏡檢測(cè)證實(shí)感染率＞90%，成功構(gòu)建穩(wěn)定FAK沉默的細(xì)胞株，并通過RT-PCR及Western blot技術(shù)檢測(cè)證實(shí)了實(shí)驗(yàn)組FAK mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)較陰性對(duì)照組顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，F(xiàn)AK沉默能抑制人源結(jié)腸癌株SW620的增殖及侵襲[6]。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組：將24只雌性裸鼠隨機(jī)分成3組，即實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組、未處理組，每組8只，在廈門大學(xué)抗癌研究中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室SPF條件下飼養(yǎng)，1周后接種，調(diào)整細(xì)胞密度至1×108，實(shí)驗(yàn)組于盲腸接種攜帶shRNA的FAK基因沉默的SW620細(xì)胞株；陰性對(duì)照組于盲腸接種攜帶陰性對(duì)照慢病毒載體的SW620細(xì)胞株；未處理組于盲腸注射未處理的SW620細(xì)胞株。

1.3.3 裸鼠接種、飼養(yǎng)觀察及取材：取左下腹1 cm切口，逐層分離挑出小鼠盲腸，實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組、未處理組各組接種相應(yīng)的SW620細(xì)胞懸液0.1 mL至漿膜層，接種過程中實(shí)驗(yàn)組裸鼠死亡1只。接種后繼續(xù)于SPF條件下動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，每天觀察裸鼠的活動(dòng)能力、進(jìn)食情況、體質(zhì)量、腹部觸診情況等。飼養(yǎng)6周后處死裸鼠，各實(shí)驗(yàn)組取盲腸、肺臟、肝臟行免疫組織化學(xué)、HE染色，以下實(shí)驗(yàn)均在廈門大學(xué)抗癌研究中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室完成。

1.3.4 HE染色、免疫組織化學(xué)染色：組織標(biāo)本取材后常規(guī)固定、包埋、洗滌、脫水、透明、浸蠟與包埋、7 μm切片、貼片，將載玻片放入60 ℃恒溫箱中烘烤2 h后，進(jìn)行常規(guī)HE染色，免疫組織化學(xué)步驟參照邁新SP試劑盒說明書進(jìn)行。免疫組織化學(xué)結(jié)果判定：利用Image Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)軟件測(cè)定每張照片中陽性區(qū)域的累積光密度（integrated optical density，IOD），取每張切片的5個(gè)視野所得IOD的平均值進(jìn)行檢測(cè)指標(biāo)的半定量分析，IOD能反映選定區(qū)域的蛋白表達(dá)總量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 本研究采用隨機(jī)對(duì)照設(shè)計(jì)。應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)用表示，樣本均數(shù)間比較用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 裸鼠死亡及原位成瘤率 注射結(jié)腸癌細(xì)胞6周后，實(shí)驗(yàn)組未出現(xiàn)死亡，體質(zhì)量及狀態(tài)均好于其他兩組，陰性對(duì)照組死亡2只，未處理組死亡2只，均有消瘦、進(jìn)食差。死亡裸鼠的原因考慮與感染、腫瘤生長等有關(guān)。各組成瘤率均為100%，大體標(biāo)本表明各組盲腸均可見成瘤，大小數(shù)量不一，色稍白，呈圓形隆起（如圖1箭頭所示）。實(shí)驗(yàn)組較其他兩組腫瘤體積更小，數(shù)量更少，盲腸形態(tài)更好，病理證實(shí)為接種的SW620癌細(xì)胞（見圖1）。

2.2 各組盲腸、肝臟、肺臟轉(zhuǎn)移及HE染色、免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

2.2.1 各組盲腸、肝肺轉(zhuǎn)移情況：實(shí)驗(yàn)組7只裸鼠1只肝轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移腫瘤結(jié)節(jié)小，且數(shù)量少，陰性對(duì)照組8只裸鼠死亡2只，存活的6只中4只發(fā)現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移灶彌漫，未處理組8只裸鼠死亡2只，余6只裸鼠均發(fā)現(xiàn)肝多發(fā)轉(zhuǎn)移。死亡裸鼠極度消瘦，呈惡液質(zhì)，并有腹水，解剖肝臟糜爛，表面呈粗糙顆粒狀，病理證實(shí)為腫瘤轉(zhuǎn)移，肺部呈實(shí)變。肝臟轉(zhuǎn)移率分別為：實(shí)驗(yàn)組14.29%，陰性對(duì)照組75.00%，未處理組100.00%，與陰性對(duì)照組及未處理組相比，實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)移率明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），陰性對(duì)照組與未處理組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。各組均未發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，肉眼均未見明顯腫瘤結(jié)節(jié)，顏色較光澤，外觀無明顯差異（見圖2）。

圖1 各組盲腸原位腫瘤

圖2 各組裸鼠肝臟

2.2.2 HE染色結(jié)果：各組盲腸HE染色顯示滿視野結(jié)腸癌細(xì)胞，細(xì)胞及組織極性紊亂，分化差，可見SW620細(xì)胞懸液注射到盲腸漿膜層后可成功成瘤。實(shí)驗(yàn)組腫瘤與正常腸管組織界限分明，而陰性對(duì)照組及未處理組中形成的腫瘤包塊浸潤周圍組織，界限不清。各組肝臟HE染色結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組腫瘤較局限，界限較分明，周圍肝臟組織完好，而陰性對(duì)照組及未處理組中形成的腫瘤包塊浸潤周圍組織，界限不清。各組肺臟HE染色顯示實(shí)驗(yàn)組肺臟形態(tài)較好，而陰性對(duì)照組和未處理組肺臟含大量紅細(xì)胞（見圖3）。

圖3 各組腫瘤HE染色圖片（×400）

2.2.3 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果：FAK蛋白表達(dá)為棕色顆粒，箭頭所示為轉(zhuǎn)移灶，結(jié)果顯示盲腸實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組及未處理組IOD（×106）值分別為2.67± 0.60、4.89±0.55、5.12±0.36，實(shí)驗(yàn)組肝組織壞死明顯少于陰性對(duì)照組和未處理組，肝臟實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組及未處理組IOD（×106）值分別為1.96±0.39，2.73±0.16，2.80±0.21。盲腸及肝臟的實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組及未處理組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），陰性對(duì)照組與未處理組相比差別均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組FAK蛋白表達(dá)明顯降低，可見實(shí)驗(yàn)組腫瘤細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)生長時(shí)仍可穩(wěn)定沉默F(xiàn)AK表達(dá)（見圖4-5）。

圖4 各組腫瘤免疫組織化學(xué)染色圖片（×400）

圖5 各組FAK蛋白質(zhì)表達(dá)條圖

3 討論

目前國內(nèi)外大量研究表明FAK在很多惡性腫瘤如腸癌、肺癌、前列腺癌、子宮附件惡性腫瘤中都過度表達(dá)[6-8]；FAK參與腫瘤細(xì)胞的增殖、抑制細(xì)胞的凋亡以及促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的黏附、遷移等。諸多研究已證實(shí)在大腸癌組織中，F(xiàn)AK在原發(fā)癌及肝轉(zhuǎn)移癌中均較正常大腸黏膜表達(dá)增高；腸腺瘤伴不典型增生組織中較正常大腸黏膜表達(dá)率高[9]。FAK可能的調(diào)節(jié)通路包括增強(qiáng)Ras基因的活化，影響MAPK的級(jí)聯(lián)激活，ERK活化后轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核內(nèi)后使部分轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子磷酸化，最終使細(xì)胞生長增強(qiáng)；同時(shí)，F(xiàn)AK下調(diào)CAS凋亡蛋白酶的表達(dá)，降低JNK、MMPs基因活性，使癌細(xì)胞凋亡減少，逐漸獲得侵襲能力[10]。文獻(xiàn)報(bào)道細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)抑制FAK的表達(dá)可有效地降低腫瘤細(xì)胞的黏附和侵襲[11-13]，可見，如人為降低FAK蛋白的表達(dá)水平，可能有望控制腫瘤的轉(zhuǎn)移及擴(kuò)散。

本研究建立在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用RNAi技術(shù)，通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SW620結(jié)腸癌細(xì)胞，達(dá)到抑制結(jié)腸癌細(xì)胞FAK蛋白的表達(dá)，為大腸癌體內(nèi)轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。本研究采用原位移植腫瘤方法，真實(shí)模擬SW620結(jié)腸癌細(xì)胞在體內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)移的生物學(xué)特征，研究FAK基因的沉默對(duì)SW620結(jié)腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移的影響。實(shí)驗(yàn)挑取干擾效果好，生長旺盛的FAK抑制的單克隆細(xì)胞株，擴(kuò)增培養(yǎng)，作為體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，與陰性對(duì)照組和未處理組細(xì)胞分別異種移植到裸鼠。本研究建立原位盲腸移植動(dòng)物模型，為大腸癌靶向基因治療提供一新的方法，在腫瘤轉(zhuǎn)移環(huán)節(jié)上給予干預(yù)或設(shè)法阻斷，將大大提高臨床療效。臨床研究表明，晚期大腸癌患者中20%～30%發(fā)生肝臟轉(zhuǎn)移[14]，10%～15%發(fā)生腹膜轉(zhuǎn)移，10%～25%發(fā)生肺臟轉(zhuǎn)移[15]，而結(jié)直腸以外的部位者較少發(fā)生轉(zhuǎn)移。本課題研究SW620結(jié)腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)中，6周后處死裸鼠，取盲腸、肝臟、肺臟染色發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組裸鼠肝臟轉(zhuǎn)移明顯少于陰性對(duì)照組和未處理組，陰性對(duì)照組和未處理組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，肝轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)結(jié)果與體外實(shí)驗(yàn)相一致；各組均未見肺部轉(zhuǎn)移情況?？赡茉蚩紤]為回盲部靜脈回流至腸系膜上靜脈后直接進(jìn)入肝臟，容易早期發(fā)生肝臟的轉(zhuǎn)移，也可能在實(shí)際回盲部種植結(jié)腸癌細(xì)胞時(shí)已破壞局部毛細(xì)血管，部分腫瘤細(xì)胞直接進(jìn)入腸系膜上靜脈，使得很早期即能發(fā)現(xiàn)肝臟轉(zhuǎn)移灶，而發(fā)生肺部轉(zhuǎn)移時(shí)腫瘤細(xì)胞必須從生長部位脫落后進(jìn)入動(dòng)脈血管，并在肺部定植后才能生長，可能需要較長的時(shí)間，在實(shí)際裸鼠飼養(yǎng)過程中，6周后裸鼠的病死率明顯上升，長時(shí)間飼養(yǎng)裸鼠很難實(shí)現(xiàn)，此外腫瘤細(xì)胞本身對(duì)靶器官的親和力可能也決定了容易發(fā)生肝臟轉(zhuǎn)移；在肝轉(zhuǎn)移的情況中，可知沉默F(xiàn)AK后的SW620結(jié)腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)組明顯低于陰性對(duì)照組和未處理組，且轉(zhuǎn)移臟器的形態(tài)、病理更好，進(jìn)一步提示FAK在腫瘤轉(zhuǎn)移中起著重要作用。

綜上所述，本研究利用構(gòu)建好的pLentilox3.7 FAK慢病毒載體在293FT細(xì)胞中包裝成慢病毒，通過感染結(jié)腸癌細(xì)胞SW620建立穩(wěn)定FAK沉默的細(xì)胞株，將細(xì)胞懸液異體移植到裸鼠體內(nèi)，并測(cè)量腫瘤生長及裸鼠肝轉(zhuǎn)移情況，在體內(nèi)證實(shí)下調(diào)SW620結(jié)腸癌細(xì)胞FAK的表達(dá)，阻斷了以FAK為主的信號(hào)傳導(dǎo)通路，能有效抑制SW620的侵襲能力，為以后臨床靶向治療大腸癌提供了一種新的思路和方法。

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（本文編輯：吳健敏）

The effect of silenced focal adhesion kinase on colorectal cancer metastasis in vivo

HONG Weiwen1, SUGuoqiang2, YING Hongan3, LIN Feng1, LIANG Weidong1. 1.Department of General Surgery, the First People’s Hospital of Taizhou, Taizhou, 318020; 2.Department of General Surgery, the First Affiliated Hospital of Xiamen University, Xiamen, 361000; 3.Special Service Ward, the First People’s Hospital of Taizhou, Taizhou, 318020

Objective: Focal adhesion kinase gene silencing by Short Hairpin RNA can effectively inhibit colorectal cancer’s metastasis were confirmed through injection of FAK-knockdown colorectal cancer cells into nude mice. Methods: Twenty-four nude mice were randomly divided into three groups which were experimental group which inject FAK-knockdown colon cancer cells, negative control group whick inject negative control colon cancer cells and untreated group which inject untreated colon cancer cells. Nude mice were sacrificed after 6 weeks and tumor formation rate, mortality, tumor growth, liver and lung’s metastasis, miscrometastasis were observed and FAK protein expression were determined with HE staining and immunohistochemical staining. Results: Tumor formation rate was 100% in each group. Distant metastases, mortality and FAK protein expression of experimental group was significantly lower than that of the other two groups (P＜0.05), meanwhile, the malignant lesion extent was lighter. While negative control group and untreated group were not significantly different (P＞0.05). Conclusion: Lentiviral packaging shRNA-mediated FAK gene silencing can significantly inhibit liver and lung metastasis of colorectal cancer. FAK is expected to be a new target for treatment of colon cancer metastasis.

focal adhesion kinase; SW620; colorectal neoplasms; nude mouse; metastasis

R735.35

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.07.007

2014-02-18

洪衛(wèi)文（1983-），男，福建龍巖人，住院醫(yī)師，碩士。