bFGF經(jīng)鼻給藥對大鼠缺血再灌注腦損傷的保護(hù)作用

姜義娜，田福榮，林倩，姚銳，趙應(yīng)征

（1.溫州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 溫州 325035；2.北京老年醫(yī)院 醫(yī)保辦，北京 100095）

·論 著·

bFGF經(jīng)鼻給藥對大鼠缺血再灌注腦損傷的保護(hù)作用

姜義娜1，田福榮1，林倩1，姚銳2，趙應(yīng)征1

（1.溫州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 溫州 325035；2.北京老年醫(yī)院 醫(yī)保辦，北京 100095）

目的：探索堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）經(jīng)鼻給藥這一新途徑對腦缺血神經(jīng)元的保護(hù)作用。方法：用頸外動脈線栓法（ECA法）制備大腦中動脈栓塞的局灶性腦缺血再灌注（I/R）動物模型，于術(shù)后24 h進(jìn)行神經(jīng)功能評分檢驗建模成功與否。對造模成功大鼠經(jīng)鼻給予bFGF治療后，分別通過神經(jīng)功能評分、TTC染色測定腦梗死體積、HE染色以及免疫組織化學(xué)法來評價其療效。結(jié)果：大鼠經(jīng)bFGF治療后，腦梗死體積顯著減少（P＜0.05）；染色結(jié)果顯示治療后大鼠的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目增加，并且p-Akt陽性細(xì)胞表達(dá)量增加。結(jié)論：bFGF通過鼻腔給藥這一新途徑能夠顯著減少缺血腦組織神經(jīng)細(xì)胞的死亡，對缺血神經(jīng)元具有較好的保護(hù)作用。

堿性成纖維細(xì)胞生長因子；缺血再灌注腦損傷；頸外動脈線栓法；鼻腔給藥；大鼠

臨床上腦血管病中缺血性者約占80%，而其中大腦中動脈（MCA）栓塞又占43%[1]，但迄今為止，能夠預(yù)防和治療缺血再灌注引起的腦損傷的治療方案或者藥品幾乎沒有，這就使很多病人在缺血再灌注后喪失勞動能力和生活自理能力，嚴(yán)重影響其生存質(zhì)量。因此在對癥治療腦缺血中風(fēng)的同時，亟待建立一個對缺血再灌注引起的腦損傷有保護(hù)和預(yù)防作用的治療方案。根據(jù)已有研究[2-4]表明，堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）對大腦神經(jīng)元具有促進(jìn)存活并且能夠刺激神經(jīng)生長、突觸形成及神經(jīng)再生。利用注射給藥的大分子的多肽藥物較難透過血腦屏障（bloodbrain barrier，BBB），而鼻腔給藥則提供了一個沿著嗅覺途徑到腦內(nèi)室的直接通道，可使藥物繞過BBB并同時減少藥物的全身性分布，從而具有高效靶向入腦及降低全身性不良反應(yīng)。因此本研究旨在通過建立一種與臨床缺血性中風(fēng)相接近的局灶性腦缺血再灌注模型，并探索經(jīng)由鼻腔給藥治療后，bFGF對缺血神經(jīng)元的保護(hù)作用，擬為臨床治療缺血再灌注引起的腦損傷提供一種可行的方案。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 健康雄性SD大鼠（SPF級）52只，體質(zhì)量（280±20）g，購自上海斯萊克實驗動物公司。飼養(yǎng)于溫度為（22±2）℃、相對濕度為（55±15）%的動物房鼠籠里，12 h光照/12 h黑暗周期變化，并且保證大鼠能夠自由取食及飲水。所涉及的動物實驗均得到了溫州醫(yī)科大學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)。52只大鼠隨機分組，16只用于模型制備方法的比較與優(yōu)化：頸總動脈線栓法（CCA法）與頸外動脈線栓法（ECA法）各8只；余下36只分成3組：假手術(shù)組（A組，n=12）、缺血再灌注組（B組，n=12）和bFGF經(jīng)鼻治療組（C組，n=12）。

1.2 儀器和試劑 MCAO栓線（2636-50，北京沙東生物技術(shù)有限公司）；大鼠腦切片模具[ZH-003，東西儀（北京）科技有限公司]；數(shù)字顯微鏡（OLYMPUS，MODEL CX31RTSF）；圖像分析系統(tǒng)（QUESTAR，DT-500 DigiCAM）；石蠟包埋機（Leica EG1150C，德國徠卡儀器公司）；石蠟切片機（Leica RM2235，德國徠卡儀器公司）；移液槍（720080-10 μL/20 μL，上海精密儀器公司）；分析天平（BS110S，北京賽多利斯天平有限公司）；bFGF凍干粉（廣州暨南大學(xué)生物技術(shù)研究開發(fā)中心）；HE染色試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）；Anti-phospho-Akt（p-Akt，Ser473）抗體（Abcam，Cambs，UK）；山羊兔IgG-HRP二抗（Abcam，Cambs，UK）；組織細(xì)胞固定液（4%多聚甲醛）（北京賽馳生物技術(shù)有限公司）；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（上海玉博生物科技有限公司）；0.9%氯化鈉溶液（河南太龍藥業(yè)股份有限公司）；水合氯醛（上海西塘生物科技有限公司）；PBS緩沖液（上海易利生化試劑有限公司）；枸櫞酸緩沖液（武漢博士德生物工程有限公司）；無水乙醇（寧波新之源化工有限公司）。

1.3 CCA法制備模型 用10%水合氯醛4 μL/g對術(shù)前12 h禁食不禁水的8只大鼠腹腔注射麻醉，并仰臥位固定于在手術(shù)臺上。將頸部與下頜之間2 cm范圍內(nèi)的毛發(fā)剃除，皮膚消毒后于頸正中開口，剪開淺筋膜，鈍性分離頸前肌群，分離并暴露頸總動脈（CCA）、頸外動脈（ECA）和頸內(nèi)動脈（ICA）。用手術(shù)線結(jié)扎CCA遠(yuǎn)心端以及ECA近分叉的地方，在CCA近分叉處用眼科剪剪一小切口，將線栓從CCA插入ICA，直到有輕微阻力，插線深度約為18 mm，說明線栓已經(jīng)達(dá)到MCA的起始部，固定后，縫合切口并消毒。缺血2 h后將線栓輕輕從ECA退出，拔出約1 cm左右，恢復(fù)血流灌注，完成腦缺血再灌注模型建立。整個手術(shù)過程以電熱毯維持大鼠體溫，控制肛溫在（37±0.5）℃。

1.4 ECA法制備模型 根據(jù)Longa等[5]提出來的大腦中動脈栓塞方法（MCAO）為基礎(chǔ)，并略作改良，具體線栓過程見圖1。具體操作如下：用10%水合氯醛4 μL/g對術(shù)前12 h禁食不禁水的另外8只大鼠腹腔注射麻醉，仰臥位固定在手術(shù)臺上。將頸部與下頜之間2 cm范圍內(nèi)毛發(fā)剃除，皮膚消毒后于頸正中開口，剪開淺筋膜，鈍性分離頸前肌群，分離并暴露CCA、ECA和ICA。于遠(yuǎn)心端用5號手術(shù)縫合線將ECA及翼顎動脈結(jié)扎，手術(shù)線活結(jié)阻斷CCA血流，用動脈夾夾閉ICA。在ECA結(jié)扎線近端做小三角切口，將栓線通過切口插入到ICA，松開ICA上的動脈夾，繼續(xù)將線栓往里約深入18 mm左右，阻斷MCA入口，結(jié)扎ECA近心端，縫合傷口并用碘伏消毒。缺血2 h后將線栓輕輕從ECA退出，松開CCA上活結(jié)，恢復(fù)血流灌注，完成腦缺血再灌注模型建立。整個手術(shù)過程以電熱毯維持大鼠體溫，控制肛溫在（37±0.5）℃。

圖1 大鼠腦血管分布及線栓插入位置

1.5 實驗動物處理和給藥方法

1.5.1 實驗動物分配：A組、B組、C組3組實驗大鼠各取4只用于TTC染色計算梗死體積，4只用于HE染色觀察腦組織梗死情況，4只用于免疫組織化學(xué)法檢測p-Akt的表達(dá)。B組與C組選擇ECA法來構(gòu)建模型。

1.5.2 鼻腔給藥具體操作：10%水合氯醛4 μL/g腹腔注射麻醉大鼠，取仰位平躺固定，10 μL移液槍吸取5 μL藥液滴入一側(cè)鼻腔。經(jīng)5 min吸收，采用相同的方法于另一側(cè)鼻孔給藥，每5 min交替鼻孔給藥，共持續(xù)30 min。C組給予bFGF溶液，總給藥量為0.33 μg/g，A、B組給予相同體積0.9%氯化鈉溶液。首次給藥時間為術(shù)后立即給藥，之后每天給藥1次，連續(xù)給藥3 d。

1.6 神經(jīng)功能評分統(tǒng)計 根據(jù)改良的Bederson評分表[6]，對兩種方法制備的缺血再灌注模型是否成功建立進(jìn)行檢驗。此外，分別在給藥治療后1 d、2 d、3 d對各組進(jìn)行神經(jīng)功能評分，觀察藥物治療后神經(jīng)功能改善狀況。

神經(jīng)功能缺損評分參照Bederson評分標(biāo)準(zhǔn)并稍作修改，具體等級評分見表1。其中，0分者（無神經(jīng)功能損傷）和5分者（過度損傷）剔除實驗，1～3分者納入實驗范圍。

表1 神經(jīng)損傷評分表

1.7 TTC染色 術(shù)后24 h，分別將兩種建模方法制備的缺血再灌注模型大鼠麻醉，灌注0.9%氯化鈉溶液。開顱取腦，取大鼠腦組織置-20 ℃冰凍20 min后，去除小腦嗅腦和低位腦干。將大腦自額葉由前往后作冠狀切成2 mm的腦片，將腦片置于1% TTC的染液中，在37 ℃避光染色約20 min，數(shù)碼相機拍照并作圖像處理，觀察各組大鼠腦組織梗死情況。此外，在第3次給藥24 h后也按上述方法對各組進(jìn)行TTC染色并進(jìn)行相關(guān)處理。

1.8 腦組織處理

1.8.1 灌注：對大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評分后，排除無神經(jīng)功能損傷的和損傷過度的術(shù)后大鼠，避免手術(shù)因素干擾bFGF治療效果。將大鼠腹腔注射麻醉，仰臥位固定，打開胸腹部，暴露出心臟，心尖穿刺灌注，快速灌注0.9%氯化鈉溶液沖洗。

1.8.2 取腦：灌注成功后，由枕骨大孔處用剪刀橫斷大鼠頭部，在枕骨大孔斜插入手術(shù)剪刀剪開頂骨，用止血鉗瓣鉗斷旁邊的頂骨[11]，注意嗅球上的頂骨也要仔細(xì)去掉，用剪刀于一側(cè)剪斷視神經(jīng)并探到顱底，將整塊的腦組織翹起。仔細(xì)剝離顱骨，以4%多聚甲醛于4 ℃下固定24 h。PBS緩沖液洗3次，每次10～20 min，然后分別在30%、50%乙醇中浸泡10～20 min，浸置于70%乙醇放入4 ℃冰箱保存。1.8.3 石蠟包埋：新鮮腦組織在進(jìn)行HE染色和免疫組織化學(xué)染色法檢測之前需要先進(jìn)行石蠟包埋。取出保存于4 ℃下70%乙醇中的組織樣品，分別浸在80%乙醇15 min，95%乙醇15 min，100%乙醇30 min，50%乙醇和50%二甲苯各15 min，二甲苯透明5～10 min，50%二甲苯和50%石蠟30 min，硬蠟1.5 h，軟蠟1.5～2.5 h，最后置4 ℃冰箱保存。

1.9 HE染色觀察神經(jīng)元形態(tài)變化 腦組織石蠟切片進(jìn)行HE染色，切片經(jīng)過恒溫烘箱脫蠟，再用遞減梯度乙醇水化，蘇木素染色后經(jīng)水返藍(lán)，再用伊紅復(fù)染，中性樹膠封片后，在光學(xué)顯微鏡下觀察病理學(xué)變化。

1.10 免疫組織化學(xué)法觀察p-Akt表達(dá)的變化

1.10.1 脫蠟水化：腦組織切片置于60 ℃烘箱中烘烤30 min，取出后置于二甲苯溶液I浸20 min、二甲苯溶液 II浸10 min，依次在無水乙醇、95%乙醇、75%乙醇各浸泡5 min，PBS洗滌2次各5 min。

1.10.2 抗原修復(fù)、封閉：將脫蠟水化的腦組織切片在3% H2O室溫封閉10 min，蒸餾水洗3次各2 min，枸櫞酸液高壓加熱5 min，自然冷卻，PBS洗滌2次各5 min，5% BSA室溫封閉10 min，甩去多余液體。

1.10.3 抗體孵育：在抗原修復(fù)、封閉后的腦組織切片中滴入I抗（適當(dāng)稀釋的IgG）50 μL，37 ℃恒溫孵育2 h或4 ℃過夜，PBS洗滌3次各5 min。

1.10.4 顯色反應(yīng)：將經(jīng)抗體孵育后的腦組織切片分別在75%乙醇、95%乙醇、無水乙醇中各浸泡5 min，二甲苯浸泡10 min，更換新鮮二甲苯再浸泡10 min，使用中性樹膠封片，晾干后在顯微鏡下觀察。

1.11 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。計量資料以表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種制備局灶性腦缺血再灌注模型方法的比較

2.1.1 神經(jīng)功能評分統(tǒng)計：兩種線栓法制備的局灶性腦缺血再灌注模型神經(jīng)功能評分結(jié)果顯示（見表2），CCA法大鼠神經(jīng)功能損傷嚴(yán)重，接近死亡的數(shù)量較多，ECA法大鼠神經(jīng)功能較穩(wěn)定，損傷嚴(yán)重程度符合后期實驗的要求。

表2 兩種造模方法的神經(jīng)功能評價結(jié)果（只）

2.1.2 TTC染色觀察腦組織梗死情況：TTC結(jié)果顯示，CCA法大鼠梗死體積過大，梗死部位沒有ECA法梗死部位準(zhǔn)確，同時未見傷及另側(cè)腦半球組織（見圖2）。兩種制備方法梗死體積經(jīng)獨立樣本t檢驗，P＜0.01，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（見圖3）。

圖2 TTC染色觀察腦組織梗死情況

圖3 比較兩種造模方法所得到的梗死體積

2.2 bFGF對ECA法制備缺血再灌注大鼠治療作用的評價

2.2.1 神經(jīng)功能評分統(tǒng)計：手術(shù)后，A組無神經(jīng)損傷癥狀；B組表現(xiàn)不能直線行走，向病灶對側(cè)偏轉(zhuǎn)，與A組對比，神經(jīng)功能損傷嚴(yán)重（P＜0.05）；而C組神經(jīng)功能評分比B組降低（P＜0.05）（見表3）。

表3 神經(jīng)功能評分（n=4，）

表3 神經(jīng)功能評分（n=4，）

與A組比：aP＜0.05；與B組比：bP＜0.05

組別術(shù)后24 h術(shù)后48 h術(shù)后72 h A組000 B組3.14±0.123.09±0.22a3.02±0.17bC組2.71±0.192.43±0.20b2.26±0.18b

2.2.2 TTC染色觀察梗死情況：經(jīng)過TTC染色后，A組腦組織沒有梗死，顏色正常。B組可見明顯的白色梗死區(qū)域（見圖4），梗死體積約占大腦總體積的26.95%；C組梗死體積縮小，梗死體積約占大腦總體積的16.61%，與B組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表4、圖5。

圖4 TTC染色梗死區(qū)域觀察

表4 腦梗死體積百分比（n=4，）

表4 腦梗死體積百分比（n=4，）

與B組比：aP＜0.05

組別梗死體積百分比（%）A組0 B組26.95±1.73aC組16.61±2.15a

圖5 比較3組大鼠的腦梗死體積

2.2.3 受損神經(jīng)元HE染色情況：蘇木素將細(xì)胞核染成藍(lán)紫色，伊紅將細(xì)胞質(zhì)染成紅色。B組大鼠的手術(shù)側(cè)（右側(cè)）腦組織在低倍鏡下均可見梗死灶，A組大鼠未見有梗死灶。再以高倍鏡觀察可見A組大鼠腦神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)基本正常，胞膜核膜清晰，核仁明顯（見圖6）。B組可見穩(wěn)定梗死灶，梗死灶中心區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞脫失明顯，殘存細(xì)胞多無完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，細(xì)胞核固縮深染，核仁消失。梗死區(qū)周圍神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目減少，且腫脹壞死脫失，分布不均勻，細(xì)胞周圍間隙增寬，水腫明顯。C組梗死灶中心神經(jīng)細(xì)胞脫失相對亦較明顯，但較B組已有明顯改善，細(xì)胞腫脹壞死數(shù)目減少，神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目增多。

2.2.4 免疫組織化學(xué)法檢測p-Akt表達(dá)：A組有豐富的p-Akt陽性細(xì)胞（細(xì)胞質(zhì)為棕黃色，細(xì)胞核染成深藍(lán)色），且細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整。B組與A組比較，神經(jīng)元的染色均變淡。C組與B組相比，染色明顯加深（見圖7）。說明大鼠腦梗死2 h再灌注72 h后，缺血的海馬區(qū)腦組織p-Akt表達(dá)降低，而用bFGF治療后，明顯增強了p-Akt的表達(dá)。

圖6 海馬區(qū)組織HE染色結(jié)果（×400）

圖7 海馬區(qū)腦組織免疫組織化學(xué)法檢測p-Akt表達(dá)（×400）

3 討論

3.1 腦缺血動物模型的確立 近年來人們對腦缺血動物模型的制作方法進(jìn)行了大量研究，建立了很多模擬人類各種腦缺血狀態(tài)的動物模型，如開顱物理阻斷血流法、自體血栓栓塞腦缺血模型、微栓子栓塞法、線栓法等[7]。線栓法制備的局灶性腦梗死模型與人類腦缺血、中風(fēng)的病理過程相似，適用于臨床腦缺血治療藥物的研究。其中，大鼠是較理想的模型動物，優(yōu)點在于它的腦血管解剖接近人類，血管性損傷部位恒定，實驗重復(fù)性較好[8]。在線栓法制備局灶性腦缺血再灌注模型時，插入線栓的長短直接關(guān)系著造模的成功與否。因大鼠大腦血管中動脈長度和直徑與其體質(zhì)量呈正相關(guān)，因此栓線的長度、直徑要與大鼠的體質(zhì)量相互匹配。Holland等[9]使用重約300 g的大鼠，進(jìn)線的深度約18.0 mm，復(fù)制了Longa的模型是比較成功，所以本實驗延用了此方法。造模完成后，大鼠不會立即蘇醒，此時大鼠體溫的保持很重要。一般在動物實驗時用肛表監(jiān)測，使用恒溫加熱毯將動物的體溫維持在37 ℃，如果有條件監(jiān)測腦溫則更可靠[10]。

本研究中，由神經(jīng)功能評分及梗死情況作出判定，與CCA法的建模方式相比較，ECA法更穩(wěn)定，并且梗死區(qū)域符合實驗所需，即ECA法優(yōu)于CCA法。

3.2 bFGF經(jīng)鼻給藥成為bFGF有效發(fā)揮腦神經(jīng)保護(hù)功能的可行途徑 雖已有文獻(xiàn)證明bFGF對急性腦卒中動物模型的神經(jīng)元具有保護(hù)作用[11-13]，但bFGF作為大分子蛋白類藥物難以透過BBB，因此全身性給藥方式（靜脈注射、腹腔注射，或皮下給藥）入腦效率極低，而且加大給藥劑量可導(dǎo)致全身性不良反應(yīng)，這使得其保護(hù)作用難以通過傳統(tǒng)的途徑實現(xiàn)。

嗅覺系統(tǒng)提供了一個直接聯(lián)系腦和外周環(huán)境的橋梁，正是由于嗅黏膜與腦存在直接轉(zhuǎn)運通路，使得一些外源性的物質(zhì)可以繞過BBB、避開肝臟的首過效應(yīng)及胃腸道中代謝酶作用而直接入腦，這一特點賦予了鼻腔給藥入腦的獨特優(yōu)勢[14]。本研究中，經(jīng)bFGF鼻腔給藥治療的腦缺血再灌注后的大鼠神經(jīng)功能得到一定的恢復(fù)，梗死體積小于非給藥組。HE染色和免疫組織化學(xué)結(jié)果也顯示，經(jīng)bFGF鼻腔給藥治療，腦缺血再灌注后的大鼠神經(jīng)元的損傷程度明顯降低，并且上調(diào)了p-Akt蛋白的表達(dá)。綜上各指標(biāo)，bFGF可以通過鼻腔給藥改善局灶性缺血的腦組織，減少缺血腦組織神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，對缺血的腦組織具有保護(hù)作用。

因此，bFGF經(jīng)鼻給藥為臨床治療腦梗死所致的腦神經(jīng)損傷修復(fù)提供了一種可行的醫(yī)療方案。然而經(jīng)鼻給藥也存在一些局限，如何將bFGF更進(jìn)一步高效地遞送入腦并同時提高bFGF的穩(wěn)定性成為我們?nèi)蘸笱芯康年P(guān)鍵。

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（本文編輯：吳昔昔）

Neruoprotective effect of bFGF on ischemic-reperfusion injury in SD rats via intranasal administration

JIANG Yina1, TIAN Furong1, LIN Qian1, YAO Rui2, ZHAO Yingzheng1. 1.School of Pharmacy, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035; 2.Medical Insurance Office, Beijing Geriatric Hospital, Beijing, 100095

Objective: To investigate the neuroprotective effects of bFGF (basic fibroblast growth factor) via intranasal administration for ischemic neurons of brain. Methods: The transient focal cerebral ischemia-reperfusion model of adult male SD rats was established with a method of line-plugging to the external carotid artery. Twenty-four hours after the reperfusion, behavioral test (neurologic deficit scoring) was carried out to evaluate the neurological deficiency. The neuroprotective effects of bFGF via intranasal administration to the model rats were evaluated with neurologic deficit score, infarct volume, histology and immunohistochemistry staining. Results: The transient focal cerebral ischemia-reperfusion model were established successfully. Comparing with the ischemia-reperfusion group, the level of infarction volume was significantly decreased (P＜0.05), the number of nerve cells were increased and the expression of p-Akt positive cells were significantly up-regulated via intranasal administration of bFGF group. Conclusion: By the new pathway of nasal administration, bFGF can decrease the infarction volume and protect neurons from cerebral ischemic injury.

bFGF; cerebral ischemia-reperfusion injury; external carotid arterial line plug method; intranasal administration; rats

R743.3

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.08.004

2014-12-22

國家自然科學(xué)基金資助項目（81272160）。

姜義娜（1978-），女，山東威海人，講師，碩士。